论文摘要
水稻稻瘟病（Magnaporthe grisea）是全球水稻种植区危害最为严重的病害之一，又名稻热病，俗称火烧瘟、吊头瘟、掐颈瘟等。该病一年四季均可对水稻造成危害，其危害遍及水稻的各个部位，一般造成水稻减产10％～20％。目前，水稻抗瘟性品种的利用和化学农药的使用仍是防治稻瘟病行之有效的措施，但由于抗瘟品种的单一化、稻瘟病菌生理小种遗传的复杂性和致病性的多样性以及化学农药的毒性和病原菌的抗药性等原因，水稻抗瘟性品种和化学农药使用在生产上都受到一定的限制。为此，水稻稻瘟病的生物防治，特别是生物农药的研究与开发，是水稻生产可持续发展的需要。嗜热蛋白是一类主要来源于嗜热微生物的热稳定蛋白，能够在高温下长时间保持活性而不变性。迄今为止，对嗜热蛋白的稳定机理从实验和理论等方面都进行了探讨，提出了各种不同的机制，目前已报道了多种不同的解释嗜热蛋白热稳定性增强的物理和化学因素，但并未发现常温细菌产生极端嗜热蛋白的报道，而多粘菌类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）对稻瘟病菌的拮抗机理仍不清楚。本文对拮抗菌多粘类芽孢杆菌LM-3菌株进行了蛋白纯化、基因克隆及其对稻瘟病的防治研究，旨在为生物农药的研发、抗稻瘟病转基因育种以及为深入研究常温菌产生极端嗜热蛋白及其对稻瘟病菌拮抗机制的深入研究奠定基础。试验结果归纳如下。1、拮抗菌LM-3发酵产物拮抗物质的纯化。本试验用加热法（85～90℃）从多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）LM-3菌株的发酵液中纯化得到2个极端嗜热多肽。稻瘟病菌平板拮抗实验表明，5μl纯化多肽对稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）抑菌率达89.6％。SDS-PAGE电泳显示纯化多肽分子量介于6000～7000 Da之间。多肽复性后，其中之一对稻瘟病菌表现出强的拮抗活性，命名为APPLM3（Antagonism Polypeptide from Paenibacillus polymyxa LM-3）；另一个则无此活性，命名为PPLM3（Polypeptide from Paenibacillus polymyxa LM-3）。2、拮抗多肽的N-末端氨基酸测序及序列比对分析。采用Edman降解法对APPLM3进行氨基酸测序，获得了其N-末端5个氨基酸序列（H2N-ANDPR）；以该序列为靶序列在NCBI（National Center for Biotechnology Information）上进行相似性检索，发现其可能与来源于Burkholderia的3个假设蛋白（或推导蛋白）相关。3、拮抗多肽热稳定性检测。纯化多肽分别在60℃、80℃、100℃下处理60 min，在120℃下分别处理20 min、40 min、60 min，并以4℃纯化多肽为对照。以上述7个处理对稻瘟病菌的拮抗活性进行了热稳定性检测，结果表明，拮抗多肽经60℃、80℃处理60 min后其活性并没有显著降低，100℃处理60 min后活性有所降低，但仍保持在90％以上；当温度增至120℃、处理20 min后拮抗多肽仍然保持了85.4％的活性。处理时间延长多肽拮抗活性降低，处理温度超过100℃后，多肽拮抗活性降低速度随加热时间和温度增加而加快，120℃处理60 min后多肽拮抗活性完全丧失。试验证明，纯化多肽对稻瘟病菌的拮抗活性的热稳定性相当高。4、拮抗多肽的基因克隆。提取LM-3基因组DNA，用Sau3AI进行不完全酶切，回收500～4000 bp的片断，将其插入pUC19的BamHI位点，并转化至DH5α大肠杆菌中，用α-互补法筛选阳性克隆。从所得的约7200个阳性转化子中在PDA／LB平板上进一步选择拮抗转化子，但由于筛选温度不易控制、目的片断过短等原因，导致了克隆试验的失败。5、以拮抗多肽为主成分的乳剂的制备及其对苗瘟的田间防效。为测定拮抗多肽APPLM3的田间表现，将LM-3发酵液与甲醇溶剂、复合型乳化剂（乳化剂OP及土温80）组配成5种微生物源乳剂。试验共设3个对照，以CK1和CK2的加权病指作为参比，CK3为农药对照，较好消除了试验误差，提高了试验精度。试验结果表明，所有农药处理的防效明显高于拮抗液直接喷雾，随着乳化剂OP在农药中含量的减少，防效反而增加，AB4防效最佳，达80.73％，但进一步减少OP含量防效则开始减弱。因此，处理AB4为本试验最佳配比，其拮抗成分、吐温80、乳化剂OP、溶剂的质量比约为50：6.5：1.75：41.75。