论文摘要
多溴联苯醚（PBDEs）广泛应用于制造工业和民用设备,如纺织品、家具、电子电器产品,以预防火灾和减少火灾损失的耐燃添加剂。在过去的几十年中,多溴联苯醚的大量生产和应用,造成了广泛的环境污染和在食物链中多溴联苯醚的积累。PBDEs在人类和其他生物体组织中的浓度大约每46年就增加2倍,在大多数人类和环境生物群组织被发现的PBDE同源物主要有BDE-47、BDE-99、BDE-100、BDE-153、BDE-154、BDE-183和BDE-209等。研究表明,PBDEs可能有潜在的神经发育毒性、生殖发育毒性和内分泌干扰作用。代谢动力学研究结果显示,PBDEs可能产生脱溴代谢产物和氧化代谢产物。由于脱溴代谢产物的高生物蓄积性和在环境中的半衰期更长,且羟化多溴联苯醚（OH-PBDEs）代谢产物比PBDEs本身具有更大的毒性作用,从而加大了PBDEs的生物学毒性作用。因此,了解PBDEs的代谢程度,脱溴和羟化代谢产物的形成过程,对于全面评估其在人类和动物体内的生物蓄积性及其他有害作用具有十分重要的意义。然而迄今为止,对于PBDEs的代谢过程尚不十分清楚。细胞色素P450占人体内异源化学物I相代谢酶的7080%,并能代谢的大量内源性化合物且与许多细胞功能有关,通常介导羟基化,脱烷基或氧化开环反应。其主要的代谢酶是CYP450s的家族的1、2和3亚家族。肝脏是细胞色素P450s（CYP450s）介导的化学物代谢的主要场所,原代肝细胞,含有丰富的CYP450s代谢酶,被认为是一个很好的模型用于PBDEs的代谢研究。但是由于诸多限制,人类的肝细胞难以获得,通常用原代大鼠肝细胞代替。虽然已有关于利用人类肝细胞微粒体或人原代肝细胞代谢PBDEs的一些研究,但迄今为止,关于人CYP450s对BDE同源物的代谢研究资料还十分有限。本研究拟通过建立的原代大鼠肝细胞和体外表达人CYP450s酶的体外代谢模型,分析和鉴定BDE-47、BDE-99和BDE-153代谢产物,特别是还原脱溴,OH和/或甲氧代谢产物,并进一步分析和验证与PBDEs代谢相关CYP450s酶。研究结果将为系统阐明PBDEs的生物转化及其毒理学效应提供依据。第一部分PBDEs体外代谢产物及相关P450酶的初步鉴定目的通过分离培养大鼠原代肝细胞,鉴定BDE-47,BDE-99和BDE-153的主要代谢产物及初步确定相关CYP450酶。方法首先分离培养大鼠原代肝细胞,分别用BDE-47,BDE-99和BDE-153处理2472 hr,然后采用中性和酚类物质分离的方法,分别萃取其脱溴和羟化代谢产物,并用GC/MS检测分析。提取上述处理细胞的mRNA,采用实时定量PCR（RT-PCR）检测经PBDEs处理后,细胞相关代谢酶的mRNA表达水平。结果PBDEs处理原代大鼠肝细胞24 hr,可以诱导CYP1A2,CYP2B1/2,尤其是CYP3A23/3A1的mRNA转录水平分别平均升高约15%,20%和120%。大鼠原代肝细胞经PBDEs处理72 hr后,约有12.2%的BDE-47、13.5%的BDE-99和5.3%的BDE-153被代谢。分别有2种氧化代谢产物3-OH-BDE-47和5-OH-BDE-47在所有经BDE-47处理的原代大鼠肝细胞的提取物中被检测;有1种脱溴代谢产物（BDE-47）和3种氧化代谢物2, 4, 5-三溴苯酚、5-OH- BDE-47和5’-OH-BDE-99在所有经BDE-99处理的原代大鼠肝细胞的提取物中被检测。但经BDE-153处理的原代大鼠肝细胞的提取物中未检测到代谢产物。第二部分人CYPs酶对PBDEs体外代谢的研究目的通过体外代谢反应体系,系统阐明CYP450s酶对PBDEs的代谢活化作用,明确关键的代谢酶。方法使用Ac-Bacmid-CYPs DNA转染昆虫细胞Sf9,在细胞中获得完整的含CYPs基因的杆状病毒;使用含CYPs基因的杆状病毒感染Sf9细胞,加入辅助因子5-ALA和Fe3+,表达CYP1A1、CYP1A2、CYP2A6、CYP2A13、CYP2C9、CYP2E1、CYP3A4和POR蛋白,Western blot检测各蛋白的表达;对各CYPs蛋白进行CO差示光谱检测CYP450s酶活性。选取相关CYP450酶对BDE-47,BDE-99和BDE-153分别进行体外代谢,通过检测清除率来测定不同CYP酶对BDE-47,BDE-99和BDE-153的代谢效率。结果成功构建真核表达Ac-Bacmid-CYPs（POR）病毒DNA并进一步获得高滴度的重组真核表达Ac-Bacmid-CYPs（POR）病毒液。体外表达CYP1A1、CYP1A2、CYP2A6、CYP2A13、CYP2C9、CYP2E1、CYP3A4和POR,Western blot检测显示上述蛋白在Baculovirus/Sf9系统中可成功表达,CYP450可出现4555 kD的条带;CO差示光谱法检测证实各CYP450s在450nm处都有明显的吸收峰,显示有酶催化活性,微粒体蛋白中CYP450s含量范围为0.080.35 nmol/mg。不同的CYP亚型对PBDEs的代谢能力存在很大的差异,人CYP1A2和CYP3A4与其他亚型CYP酶相比,其代谢PBDEs的能力显著较高,分别对BDE-47和BDE-99清除率约为30%,对BDE-153的清除率约为20%。结论利用体外代谢系统,分别鉴定了2种BDE-47代谢产物,4种BDE-99的代谢产物,而且这些产物均被实验证明可诱导比母体化合物更大毒性作用;经PBDEs处理原代大鼠肝细胞,可以诱导CYP1A2,CYP2B1/2,尤其是CYP3A23/3A1基因的mRNA转录水平升高。确定了人CYP3A4和CYP1A2可能是PBDEs的重要代谢酶。