拂子茅属（Calamagrosits spp.）植物内生真菌的分类及其生理学特征研究

论文摘要

Neotyphodium（Ascomycota,Hypocreales,Clavicipitaceae）属真菌是禾本科植物内生真菌,几乎没有形成子座的能力,在宿主植物体内完成其全部的生活史,只能通过植物种子或营养体进行无性繁殖。在经典分类学研究中,Neotyphodium属内生真菌被认为是Epichlo（e|¨）属真菌的无性世代。Epichlo（e|¨）属内生真菌在其生活史的绝大多数阶段在宿主体内生长,但在宿主植物进入繁殖阶段时,Epichlo（e|¨）属内生真菌会在宿主植物上产生子座,进入有性生殖循环。Epichlo（e|¨）属和Neotyphodium属真菌的关系紧密而复杂,现被统称为epichlo（e|¨）内生真菌。本研究调查了中国西北和东部地区不同生境的广义拂子茅属（Calamagrostis sensolato）植物中Neotyphodium属内生真菌的分布情况,对从我国拂子茅属植物中分离的Neotyphodium属内生真菌进行了较为系统的分类和菌株生理特征研究。首先,本研究调查了中国西北和东部地区不同生境的广义拂子茅属植物中Neotyphodium属内生真菌的分布。从新疆、青海、甘肃、江苏、安徽等地区,共采集拂子茅属植物样品437株。调查发现西北3省区所有305个广义拂子茅属植物样品中都不含有内生真菌;而采集自东部的样品中,南京的无性系拂子茅属植物和黄山的拂子茅（C.epigeios）含菌率为100%,而同样采自南京的抽穗的拂子茅（C.epigeios）则完全不含内生真菌。第二,经过两年多的连续观察,没有发现含有内生真菌的南京拂子茅植株抽穗,无法通过传统手段鉴定。我们通过解剖叶片上、下表皮,比对叶表皮的微形态特征;测定rDNA-ITS序列,进行系统发育学分析,将宿主植物鉴定为拂子茅属（Calamagrostis sp.）。这套禾本科植物鉴定方法为今后的内生真菌宿主鉴定工作提供了新的途径。第三,从采集自南京的29株着生子座的植株和79株不着生子座的植株中分离得到了20个菌株,各菌株的形态特征基本相同。从安徽黄山采集到正常抽穗的拂子茅（C.epigeios）16株,全部检出了内生真菌,从中分离得到了2个菌株,各菌株的形态特征基本相同。根据菌株的生活史和形态特征,分离菌株被鉴定为Neotyphodium属真菌。与已知的Neotyphodium属真菌相比,南京和黄山两地的分离菌株的形态特征有较明显的差别,同时发现两地菌株之间也存在明显差异。第四,本研究对分离自南京拂子茅属植物（Calamagrostis sp.）中的5株Neotyphodium属真菌菌株的tefA和tubB基因序列进行了测序,并对epichlo（e|¨）内生真菌中所有已经建立的种进行了系统发育分析。结果表明南京的5株菌株间的tefA和4株菌株间的tubB基因序列完全相同;对测得的序列进行Blast搜索,搜索结果全部为epichlo（e|¨）内生真菌的序列;同时,根据tefA和tubB基因序列构建的系统发育树显示,南京的菌株形成一个独立的分枝,并与同来自翦股颖族（Agrostideae）禾草的E.amarillans和E.baconii的种群比较接近。分子系统发育学分析支持分离自南京拂子茅属植物的菌株为一个独立起源的新种。宿主植物的种类和地理分布,真菌的形态学特征,分子系统发育学分析等三个方面结果支持,分离自南京拂子茅属植物的Neotyphodium属真菌为一个新种。由于长有极长的子座而又未发现有性生殖阶段,我们将它命名为Neotyphodium stromatolongus Y.Ji,L.Zhan et Z.Wang,sp.nov.。第五,本文对从江苏南京和安徽黄山的拂子茅属植物体内分离出的Neotyphodiun属内生真菌菌株进行了生理特性的研究,主要从pH值、碳源、氮源等三个方面进行。结果表明:（1）两地菌株的最适生长pH都为5.0左右,黄山菌株在极低的pH值条件下（3.0）依然能够生长;（2）在供试碳源中,南京菌株适宜利用葡萄糖和蔗糖,黄山菌株适宜利用葡萄糖、蔗糖和菊糖;（3）南京菌株利用酸水解酪蛋白和大豆蛋白胨最佳,黄山菌株利用大豆蛋白胨和硝酸钾最佳;（4）南京菌株在各种碳源和氮源条件下都比黄山菌株生长速度快。以上结果显示,南京菌株和黄山菌株在生理学特征方面有比较明显的差别。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 文献综述 Neotyphodium属真菌的研究概况以及Agrostideae植物的内生真菌研究现状
• 一、禾本科植物内生真菌的研究概况
• 二、Neotyphodium属真菌生物多样性研究
• 三、Neotyphodium属内各种的基本特性
• 四、Agrostideae植物的内生真菌研究
• 五、本研究的意义
• 第二部分 实验内容
• 第一章 拂子茅属植物Neotyphodium属内生真菌分布调查
• 1 材料和方法
• 1.1 样品的采集、保存及鉴定
• 1.2 内生真菌的检测
• 2 结果
• 2.1 拂子茅属植物的调查和采集
• 2.2 内生真菌的检测
• 2.3 拂子茅属植物内生真菌的分布
• 3 讨论
• 第二章 拂子茅属植物的鉴定
• 前言
• 1.材料与方法
• 1.1 宿主植物群落的调查和植物样品的采集、保存
• 1.2 宿主植物的外部形态特征观察
• 1.3 叶表皮微形态特征观察
• 1.4 宿主植物基因组DNA提取
• 1.5 宿主植物的rDNA-ITS序列分析
• 2 结果
• 2.1 植物的形态学特征
• 2.2 南京植株的叶表皮微形态特征
• 2.3 南京植株的分子系统发育学分析
• 2.4 植物的鉴定结果
• 3 讨论
• 第三章 拂子茅属植物中内生真菌的分离、培养和菌物学特征
• 前言
• 1 材料和方法
• 1.1 宿主植物群落的调查和植物样品的采集、保存
• 1.2 子座的特征观察
• 1.3 内生真菌的分离和保藏
• 1.4 分离菌株的培养和形态学特征
• 1.5 内生真菌的交配试验
• 2 结果
• 2.1 宿主植物的调查、采集
• 2.2 宿主植物体内内生真菌的形态特征和分布
• 2.3 内生真菌子座的形态特征
• 2.4 内生真菌的分离、培养及形态学特征
• 2.5 人工交配实验和不同时期子座的形态
• 3 讨论
• 第四章 南京拂子茅属植物内生真菌的分子系统发育研究
• 前言
• 1 材料与方法
• 1.1 供试菌株
• 1.2 总DNA的提取
• 1.3 相关序列的PCR扩增
• 1.4 扩增片段的测序
• 1.5 菌株的系统发育分析
• 2 结果与分析
• 2.1 总DNA的提取
• 2.2 目的基因片段的PCR扩增和测序
• 2.3 目的基因片段的比对
• 2.4 菌株的分子系统发育学分析
• 3 讨论
• 第五章 拂子茅属植物内生真菌的生理学特征
• 前言
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 不同pH值对内生真菌生长的影响
• 1.3 固体培养基中不同碳源对内生真菌生长的影响
• 1.4 不同氮源对内生真菌生长的影响
• 1.5 数据统计
• 2 结果与分析
• 2.1 不同pH值对内生真菌生长的影响
• 2.2 固体培养基中不同碳源对内生真菌生长的影响
• 2.3 两地菌株在各种碳源条件下的菌落形态比较
• 2.4 不同氮源对内生真菌生长的影响
• 2.5 两地菌株在各种氮源条件下的菌落形态比较
• 3 讨论
• 3.1 接种方法
• 3.2 不同pH值对内生真菌生长的影响
• 3.3 固体培养基中不同碳源对内生真菌生长的影响
• 3.4 固体培养基中不同氮源对内生真菌生长的影响
• 综合讨论
• 全文结论
• 参考文献
• 攻读硕士期间发表的学术论文
• 致谢