论文摘要
轮枝镰孢菌（Fusarium verticillioides）是引起玉米穗粒腐和茎秆腐等病害的重要病原真菌。全球的玉米种植区域广泛受到该病原菌的危害,给玉米安全生产造成重大破坏。更为严重的是,其在玉米穗粒上能产生伏马菌素等多种真菌毒素,食用被真菌毒素污染的玉米后会对动物和人类的健康造成严重损害。然而,我们对该病原真菌的植物致病机制和真菌毒素生物合成机理知之甚少。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）已被报道参与多种丝状病原真菌的重要生理过程,但在轮枝镰孢菌中MAPK类基因的功能并未见报道。本研究通过反向遗传学研究方法,以Fv7600为野生型菌株,首次对轮枝镰孢菌的MAPK基因FvMK1及其下游调控的转录因子FvST12进行了鉴定和功能研究。主要结论如下：（1）通过以禾谷镰孢菌（F. graminearum）直系同源的MAPK基因GPMK1编码的蛋白为靶序列,采用BlastP搜索,在轮枝镰孢菌基因组中获得了一个相似度达98%的新基因（FVEG05063.2）,命名为FvMK1。该基因编码一个大小为355个氨基酸的多肽,具有TEY双重磷酸化位点和保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域。遗传进化树分析表明,该FvMK1基因在丝状真菌中高度保守。（2）采用双接头PCR （Double-joint PCR）构建基因敲除载体,并通过原生质体介导的真菌遗传转化方法,获得了FvMK1基因敲除突变体。Southern杂交表明,该基因在轮枝镰孢菌基因组中以单拷贝形式存在。相比野生型菌株Fv7600,突变体Fvmk1表现出严重的生长缺陷,生长速率显著下降,尤其是气生菌丝显著减少。还表现出分生孢子产量下降50%,但大分生孢子比例明显升高。对孢子萌发没有明显影响。（3）植物致病性试验表明,FvMK1基因对于轮枝镰孢菌的致病力起关键调控作用。在玉米穗粒和玉米茎秆上,Fvmk1突变体几乎完全丧失致病力。野生型FvMK1基因能恢复突变体的致病力。进一步互补稻瘟菌（Magnaporthe oryzae） pmkl突变体表明,尽管轮枝镰孢菌在致病侵染过程中不需要形成附着胞,FvMK1基因依然能够在功能上互补pmk1突变体,使其恢复附着胞形成和致病能力。（4）FvMK1基因能正向调控轮枝镰孢菌伏马菌素B1（FB1）的生物合成,并影响与FB1生物合成相关基因的表达。Fvmk1突变体显著降低FB1产量,其中FB1/Erg（甾醇）的比例仅为野生型的50%。实时荧光定量PCR （qRT-PCR）分析表明,在Fvmk1突变体中与FB1生物合成相关的两个重要基因FUM1和FUM8的表达量分别比野生型下降了12倍和3倍。（5）有性交配试验表明,FvMK1基因对于轮枝镰孢菌的有性交配调控过程并非必须的。虽然丧失了雌性育性,但当Fvmk1突变体作为雄性菌株交配时,突变体与野生型Fv7600一样能正常产生出子囊壳和子囊孢子。（6） FvMK1-GFP荧光融合蛋白表达和亚细胞定位分析表明,FvMk1蛋白在分生孢子、芽管和菌丝等多个细胞阶段持续表达,且主要分布在细胞核中。蛋白印迹分析表明,FvMk1蛋白磷酸化水平受到上游Gbb1蛋白调控。（7）以尖孢镰孢菌（F. oxysporum） STE12类转录因子FoST12蛋白序列为比对靶序列,在轮枝镰孢菌基因组搜索到一个与其相似度高达98%的同源性蛋白（FVEG05267.3）,命名为FvST12。结构分析表明该基因含有STE Homedomain和C2H2锌指（Zinc Finger）的结构域。（8）通过原生质体介导的基因敲除方法,获得了FvST12基因敲除突变体Fvst12。Southern杂交表明,该FvST12基因在轮枝镰孢菌基因组中以单拷贝形式存在。突变体Fvst12在菌株营养生长、菌落形态、分生孢子产量、渗透和氧化胁迫等方面与野生型Fv7600无显著差异。（9）致病力分析表明,FvST12参与调控轮枝镰孢菌的致病力,突变体的致病力显著下降。将野生型FvST12基因互补到Fvst12突变体中能恢复突变体的致病力。基因表达分析表明,FvST12基因在轮枝镰孢菌致病侵染生长阶段持续大量表达。（10）推测FvST12为轮枝镰孢菌MAPK基因FvMK1的功能下游转录因子之一。且该转录因子主要参与致病性的调控,可能同时存在多个其他的功能下游转录因子参与营养生长、产孢量等功能的调控。