论文摘要
自然流产是常见的病理妊娠之一,发病率高,病因复杂。据统计,其发病率高达10%～15%,包括临床前流产在内的自然流产发生率甚至高达70%。在对自然流产病因的研究中,感染、染色体异常、生殖器畸形及内分泌疾病等已研究得比较清楚,但仍有高达60～70%的患者病因不明。近几年研究表明,不明原因的自然流产主要与免疫因素有关。目前对自身免疫性自然流产如抗磷脂综合征等研究较多,同种免疫性自然流产如封闭抗体缺乏也做了一些研究,治疗已经取得一定疗效,但仍有部分患者治疗效果不理想,成为临床上难治性不育的主要原因,这给患者带来沉重的心理负担,造成家庭的不稳定,并成为一个重要的社会问题,因此需要对自然流产的病因及治疗进行更深入的研究。近年免疫遗传学表明免疫与遗传有关,基因表达量的异常可以引起免疫功能的紊乱,导致免疫性疾病的发生,这为探讨免疫性疾病的发病机制开辟了新途径。那么,不明原因性自然流产患者是否存在免疫遗传的异常呢?最新国内外研究表明,人类白细胞抗原-G（human leukocyteantigen-G,HLA-G）的下降能引起机体免疫失调,导致胚胎受到免疫攻击而流产。自然流产患者体内HLA-G抗原表达异常是否与基因异常有关,是否影响蜕膜自然杀伤（natural killer,NK）细胞的功能,目前尚不清楚。因此,本课题研究不明原因性自然流产患者绒毛外滋养细胞HLA-G基因表达水平的变化,HLA-G基因甲基化程度在体外对绒毛外滋养细胞的HLA-G基因表达水平和蜕膜NK细胞功能的影响,探讨HLA—G基因甲基化与不明原因性自然流产的关系,旨在从基因水平调控免疫应答反应,为最终解决自然流产这一常见病理妊娠提供理论依据。同时也为阐明自然流产的免疫遗传学发病机制开辟新途径,为临床上有效治疗不明原因性自然流产寻找新方案。论文分为四部分。第一部分用不明原因性自然流产患者和正常妇女的早孕绒毛组织进行原代绒毛外滋养细胞培养;第二部分探讨不明原因性自然流产患者和正常早孕妇女的绒毛外滋养细胞上HLA-G基因在mRNA、蛋白水平的表达及甲基化程度是否存在差异;第三部分探讨不明原因性自然流产患者和正常妇女的子宫蜕膜NK细胞的亚型和功能的差异,以及HLA-G抗原浓度对NK细胞功能的影响;第四部分探讨去甲基化药物对于HLA-G基因在甲基化程度、mRNA、蛋白水平表达的影响。第一章人早孕期绒毛外滋养细胞的原代细胞培养及鉴定目的:培养出原代绒毛外滋养细胞,为本研究提供人绒毛外滋养细胞。方法:获取不明原因性自然流产患者（研究组）和正常早孕妇女（对照组）的绒毛组织,各20例。用原代培养方法培养出绒毛外滋养细胞,进一步纯化,并用免疫细胞化学染色（角蛋白CK17、波形蛋白、HLA-G抗原）鉴定绒毛外滋养细胞。结果:研究组和对照组均成功培养出原代绒毛外滋养细胞,台盼兰染色显示大于90%绒毛外滋养细胞存活,用波形蛋白、角蛋白、HLA-G抗原进行免疫细胞化学染色,显示所培养的细胞为绒毛外滋养细胞。第二章不明原因性自然流产患者绒毛外滋养细胞上HLA-G基因的表达水平目的:研究不明原因性自然流产患者HLA-G基因mRNA、蛋白水平的表达及是否存在甲基化,,探讨HLA—G基因甲基化对HLA-G基因表达水平的影响。方法:采用Western Blot比较两组绒毛外滋养细胞HLA-G基因在蛋白质水平的表达情况;采用免疫细胞化学染色比较两组绒毛外滋养细胞HLA-G抗原的表达情况;采用RT-PCR比较两组绒毛外滋养细胞HLA-G基因在转录水平的表达情况;采用甲基化特异性PCR比较两组绒毛外滋养细胞HLA-G基因甲基化程度。结果:1、经Gelpro analyzer分析软件分析图像,研究组绒毛外滋养细胞上HLA-G蛋白/GAPDH比值为0.669±0.016,对照组为1.276±0.030。两组比值经过两独立样本秩和检验比较,研究组绒毛外滋养细胞HLA-G蛋白表达低于对照组（P＜0.01）,差异有显著性。2、研究组绒毛外滋养细胞HLA-G染色成黄色,对照组绒毛外滋养细胞染色呈棕黄或棕褐色。综合染色强度和阳性细胞所占比例进行平均半定量处理,两组绒毛外滋养细胞的HLA-G抗原表达强度经x2检验,研究组绒毛外滋养细胞的HLA-G抗原表达强度低于对照组（P＜0.01）,差异具有显著性。3、经Gelpro analyzer分析软件分析图像,研究组绒毛外滋养细胞上HLA-G mRNA/β-actin比值为0.151±0.012,对照组为1.826±0.054。两组比值经过两独立样本秩和检验比较,研究组绒毛外滋养细胞上HLA-G mRNA水平低于对照组（P＜0.01）,差异有显著性。4、研究组中共有11例绒毛外滋养细胞上HLA-G基因存在甲基化状态,而9例HLA-G基因呈去甲基化状态;对照组绒毛外滋养细胞上HLA-G基因呈去甲基化状态。结论:1、不明原因性自然流产患者绒毛外滋养细胞上HLA-G基因表达水平下降;2、HLA-G基因表达水平下降部分与基因甲基化有关,还有一部分可能与其他基因调控有关。第三章不明原因性自然流产患者子宫蜕膜NK细胞亚型及功能变化的研究目的:研究不明原因性自然流产患者的子宫蜕膜NK细胞是否存在亚型及功能的变化。方法:用流式细胞仪检测研究组和对照组的子宫蜕膜NK细胞D56+CD16+亚型和CD56+CD16-亚型;并将两组的子宫蜕膜自然杀伤细胞与绒毛外滋养细胞共同培养,采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测两组子宫蜕膜自然杀伤细胞对绒毛外滋养细胞的影响。结果:1、研究组蜕膜CD56+CD16+NK细胞比例为20.327±2.495%,对照组为10.560±1.050%,两者经x2检验,研究组CD56+CD16+亚型比例显著高于于对照组,差异有显著性（P＜0.05）;CD56+CD16-NK细胞比例为70.538±4.637%,对照组为76.349±3.871%,两者经x2检验,研究组CD56+CD16-亚型比例低于于对照组,但差异无统计学意义（P＞0.05）。2、研究组蜕膜NK细胞杀伤活性为18.755±2.378%,有17例存在杀伤活性异常增高,杀伤活性异常增高率为85%;对照组蜕膜NK细胞杀伤活性为8.195±1.582%,有4例存在杀伤活性异常增高,杀伤活性异常增高率为20%。两组经x2检验,研究组蜕膜NK细胞杀伤活性显著高于对照组（P＜0.05）,研究组蜕膜NK细胞活性异常增高率显著高于对照组（P＜0.01）。3、0umol/L、10 umol/L和100 umol/L HLA-G抗原下自然流产患者蜕膜NK细胞的杀伤活性分别为18.755±2.378%、12.065±1.983%和8.209755±1.045%,三组经多样本x2检验,组间蜕膜NK细胞杀伤活性有显著性差异（P＜0.05）。结论:1、自然流产患者的CD56+CD16+亚型NK细胞比例增高,CD56+CD16-亚型NK细胞比例减少,同时杀伤活性异常增高,导致免疫功能紊乱;2、免疫功能紊乱可能与HLA-G基因水平下调、基因甲基化有关。3、免疫遗传异常是不明原因性自然流产的重要因素。第四章5’—氮杂2’—脱氧胞苷对不明原因性自然流产患者绒毛外滋养细胞HLA-G基因甲基化状态及表达水平的影响目的:研究去甲基化药物对HLA-G基因甲基化程度及表达水平的影响。方法:20例不明原因性自然流产患者随机分为处理组和未处理组,每组各10例,处理组经甲基化转移酶抑制剂5’—氮杂2’—脱氧胞苷处理原代绒毛外滋养细胞。采用Western Blot、免疫细胞化学染色、RT-PCR、甲基化特异性PCR比较两组绒毛外滋养细胞HLA-G基因在mRNA、蛋白质水平的表达情况及甲基化程度。结果:1、经Gelpro analyzer分析软件分析图像,处理组绒毛外滋养细胞上HLA-G蛋白/GAPDH比值为1.245±0.047,未处理组为0.652±0.017。两组比值经过两独立样本秩和检验比较,处理组绒毛外滋养细胞HLA-G蛋白表达高于对照组（P＜0.01）,差异有显著性。2、处理组绒毛外滋养细胞HLA-G染色呈棕黄或棕褐色,未处理组绒毛外滋养细胞染色成黄色。综合染色强度和阳性细胞所占比例进行平均半定量处理,两组绒毛外滋养细胞的HLA-G抗原表达强度经x2检验,研究组绒毛外滋养细胞的HLA-G抗原表达强度高于对照组（P＜0.01）,差异具有显著性。3、经Gelpro analyzer分析软件分析图像,研究组绒毛外滋养细胞上HLA-G mRNA/β-actin比值为2.018±0.083,对照组为0.147±0.011。两组比值经过两独立样本秩和检验比较,研究组绒毛外滋养细胞上HLA-G mRNA水平高于对照组（P＜0.01）,差异有显著性。4、处理组绒毛外滋养细胞上HLA-G基因呈去甲基化状态;部分未处理组绒毛外滋养细胞上HLA-G基因存在甲基化状态,而部分未处理组绒毛外滋养细胞上HLA-G基因呈去甲基化状态。结论:经过去甲基化药物处理后,自然流产患者HLA-G基因呈去甲基化状态,基因表达水平上调,去甲基化治疗可望作为自然流产新的治疗方法。
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相关论文文献
- [1].甲酸基肽受体2抑制滋养细胞增殖侵袭功能的机制[J]. 温州医科大学学报 2018(08)
- [2].MMP-9在绒毛外滋养细胞诱导内皮细胞凋亡中作用的研究[J]. 现代妇产科进展 2010(03)
- [3].IMP3表达与绒毛外滋养细胞(EVT)侵袭增殖活性的相关性分析[J]. 中国妇产科临床杂志 2020(05)
标签：绒毛外滋养细胞论文; 原代培养论文; 甲基化论文; 自然流产论文; 自然杀伤细胞论文; 蜕膜论文; 氮杂脱氧胞苷论文;