叶片衰老抑制基因PSAG12-IPT转化马铃薯的研究

论文摘要

ipt（异戊烯基转移酶）基因是细胞分裂素合成过程中的关键酶基因,其表达产物可促进细胞细胞分裂素的合成,进而调控植物的生长发育过程,延缓植物的衰老过程,有利于植物的生长。将ipt（异戊烯基转移酶）基因与PSAG12（拟南芥衰老专一启动子）相连,形成的嵌合基因PSAG12-ipt能够明显延缓植物的衰老,提高其生物产量和结籽数。本研究利用PSAG12-ipt基因对四个马铃薯普通栽培种材料进行遗传转化研究,探讨PSAG12-ipt基因对马铃薯叶片衰老的延衰作用,试图为提高马铃薯的产量或创造高产种质资源探索一条新途径。本研究结果如下: 1.建立了马铃薯遗传转化体系。以马铃薯四个普通栽培种材料的试管苗茎段、叶片外植体作为转化受体;以MS+NAA0.25 mg/L+2,4-D 0.25 mg/L作为愈伤诱导和分化培养基;以Kan 50mg/L、75mg/L分别作为愈伤组织诱导和生根的选择压。得到优化的遗传转化体系是:外植体预培养2天,农杆菌浓度OD600为0.2～0.5,浸染时间为8分钟,共培养3天后进行选择培养。另外,在培养基中加1%Na2SO3可有效防止褐化并对愈伤生长和分化有促进作用。 2.获得了转化再生的马铃薯阳性植株。对获得的Kanr植株进行了双重PCR分子检测,部分Kanr植株扩增出了2.2kb和720bp左右的目的片段,初步表明PSAG12-ipt基因已导入受体基因组。 3.转基因马铃薯植株具有明显的延缓衰老的表现。对双重PCR检测为阳性的植株进行的生长观察证实,“Atlantic-6”、“Atlantic-28”和“Atlantic-32”的植株发育正常且明显延缓衰老进程。对三株转化植株与对照不同生长时期叶片叶绿素、细胞分裂素、SOD酶活和MDA积累进行了检测与分析,表明,转化植株的叶绿素、细胞分裂素、SOD酶活明显高于对照,而MDA积累明显低于对照,进一步证实,外源基因ipt有可能在“Atlantic-6”、“Atlantic-28”和“Atlantic-32”植株中进行了表达,进而促进了叶片细胞分裂素的生物合成途径。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 缩略词表
• 第一章 文献综述
• 第一部分 植物衰老的机理及抗衰老基因工程研究进展
• 1 植物叶片衰老概述
• 1.1 植物叶片衰老的因素
• 1.1.1 环境因子
• 1.1.2 自主调节因子
• 1.2 植物叶片衰老机理
• 1.2.1 基因调控假说
• 1.2.2 “自由基伤害”假说
• 1.2.3 激素调节理论
• 1.3 植物叶片衰老的形态与生理指标
• 1.3.1 叶片衰老的形态指标
• 1.3.2 叶片衰老的生理指标
• 1.4 植物叶片衰老的生理生化变化
• 1.4.1 叶片衰老中叶绿素含量的变化
• 1.4.2 叶片衰老中蛋白质含量的变化
• 1.4.3 衰老叶片光合速率的变化
• 1.5 植物叶片衰老相关基因
• 1.5.1 衰老下调基因
• 1.5.2 衰老上调基因
• 2 叶片衰老与作物产量
• 3 细胞分裂素在植物抗逆、延衰中的作用
• 3.1 细胞分裂素的生物合成途径
• 3.2 细胞分裂素在植物延缓衰老中的作用
• 3.2.1 细胞分裂素与营养物质运输
• 3.2.2 激素间的相互作用对叶片衰老的调控
• 3.3 细胞分裂素在植物抗逆性中的作用
• 4 调控细胞分裂素生物合成相关基因及其研究进展
• 4.1 细胞分裂素生物合成相关酶基因
• 4.2 IPT基因在植物叶片抗衰老基因工程中的研究与应用
• 第二部分 植物遗传转化研究进展
• 1 植物遗传转化方法
• 1.1 直接遗传转化
• 1.2 载体系统转化
• 1.2.1 T-DNA转移机理
• 1.2.2 农杆菌TI质粒载体系统
• 1.2.3 农杆菌转化的优缺点
• 2 马铃薯遗传转化研究进展
• 2.1 马铃薯生产及育种概况
• 2.2 马铃薯转基因研究状况
• 2.3 马铃薯转基因的方法
• 3 研究的目的、意义
• 4 本研究的技术路线
• 第二章 转PSAG12-IPT基因马铃薯植株的获得
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 供试材料
• 1.1.2 农杆菌菌株及质粒
• 1.1.3 主要试剂
• 1.2 研究方法
• 1.2.1 质粒的PCR鉴定
• 1.2.2 马铃薯遗传转化受体系统的建立
• 1.2.3 遗传转化体系的优化
• 1.2.4 农杆菌工程菌转化外植体的方法
• 1.2.5 转基因植株PCR检测
• 2 结果与分析
• 2.1 农杆菌工程菌PCR鉴定
• 2.2 马铃薯遗传转化受体系统的优化
• 2.2.1 马铃薯高频再生系统的建立
• 2.2.2 受体材料的KAN抗性鉴定
• 2.3 遗传转化体系的优化
• 2.3.1 预培养时间对转化的影响
• 2.3.2 农杆菌浓度和浸染时间对转化的影响
• 2.3.3 共培养时间对转化的影响
• 2.3.4 转化受体培养中褐化的抑制
• 2.4 马铃薯不同品种的转化效果
• 2.5 转化植株PCR检测
• 3 讨论
• 3.1 马铃薯基因转化受体系统的建立
• 3.2 马铃薯遗传转化系统的优化
• 3.3 转化基因型依赖性问题
• 3.4 转化植株分子检测
• 第三章 植株生理指标测定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料与试剂
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 取样
• 1.1.3 主要生化试剂
• 1.1.4 主要试剂配制
• 1.1.5 所需基本仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 生长观察试验
• 1.2.2 植株生理指标测定
• 2 结果与分析
• 2.1 生长观察试验
• 2.2 马铃薯叶片衰老过程中各项生理指标测定
• 2.2.1 马铃薯植株叶片衰老过程中各项生理指标相关性分析
• 2.2.2 叶绿素含量测定
• 2.2.3 细胞分裂素含量变化
• 2.2.4 SOD酶活性、MDA含量的变化
• 3 讨论
• 第四章 结论
• 图版Ⅰ
• 图版Ⅱ
• 图版Ⅲ
• 图版说明
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介
• 导师简介
• 独创性申明