乳酸菌细菌素LLC518的分离纯化及制备

论文摘要

细菌素是一些细菌产生的抑菌物质，具有作为食品防腐剂以提高食品安全性的潜在应用价值。本文对Lacticin LLC518的吸附特性、作用方式、毒理学特性、分离纯化方法及其喷雾干燥条件进行了研究，为Lacticin LLC518的工业化生产与实际应用提供理论依据。本研究首先对Lacticin LLC518吸附于其产生菌乳酸乳球菌LLC518的规律作了探讨。Lacticin LLC518在pH6.0时对乳酸乳球菌LLC518空载细胞的吸附率达到100%，pH2.0时吸附率为0。其次采用pH吸附、DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析、RP-HPLC三步法对Lacticin LLC518进行分离纯化。Lacticin LLC518的得率为3.19%，比活为1526.95AU/mg，纯化了143.11倍。另外，还采用硫酸铵沉淀、Sephadex G-50凝胶层析、RP-HPLC三步法对Lacticin LLC518进行分离纯化。Lacticin LLC518的得率为17.97%，比活为411.52AU/mg，纯化了38.57倍。在Lacticin LLC518纯化的基础上对其进行LC-MS与MALDI-TOF-TOF-MS质谱检测，获得LacticinLLC518的分子量为3347Da，与电泳检测相符合。然后通过单因素实验、PB设计、BB设计与响应面优化，获得了LacticinLLC518的最佳喷雾干燥条件为：辅料比15.29%、进风温度150.24°C、蠕动泵流速1194.6mL/h。在此条件下，Lacticin LLC518的总活力达到了74112.13AU，是原始水平的2.01倍。最后还对Lacticin LLC518的作用方式与毒理学特性作了分析。在4°C时，Lacticin LLC518对于乳杆菌LPX801与单核增生李斯特菌有较强的杀菌作用；37°C时，Lacticin LLC518对于乳杆菌LPX801的作用方式为杀菌，对于单核增生李斯特菌的作用方式为抑菌。小鼠的毒理学实验表明， Lacticin LLC518的最大耐受量为1.44g/kg。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略词
• 文献综述
• 1 引言
• 1.1 研究意义与理论依据
• 1.2 本研究拟解决的问题
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 试剂的配制
• 2.1.4.1 Lowry 法测蛋白浓度试剂的配制
• 2.1.4.2 缓冲液的配制
• 2.1.4.3 Tricine-SDS-PAGE 电泳试剂的配制
• 2.1.4.4 电泳样品缓冲液与低分子量蛋白质标准品
• 2.1.5 主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 乳酸乳球菌 LLC518 种子液的制备
• 2.2.2 乳酸乳球菌 LLC518 发酵液的制备
• 2.2.3 指示菌液的制备
• 2.2.4 抑菌作用的测定
• 2.2.4.1 抑菌作用测定
• 2.2.4.2 细菌素效价的测定
• 2.2.5 蛋白浓度的测定（Lowry 法）
• 2.2.5.1 蛋白质浓度标准曲线的制作
• 2.2.5.2 样品蛋白质浓度的测定
• 2.2.6 细菌素对 pH 稳定性的测定
• 2.2.7 细菌素作用方式的测定
• 2.2.8 乳酸乳球菌 LLC518 生理曲线的测定
• 2.2.9 pH 对乳酸乳球菌素 Lacticin LLC518 吸附率影响
• 2.2.9.1 排除缓冲液的干扰
• 2.2.9.2 空载细胞对细菌素的吸附作用
• 2.2.9.3 发酵液中 Lacticin LLC518 对菌体细胞的吸附作用
• 2.2.10 乳酸乳球菌素 Lacticin LLC518 的分离
• 2.2.10.1 硫酸铵沉淀法分离乳酸乳球菌素 Lacticin LLC518
• 2.2.10.2 pH 吸附法分离乳酸乳球菌素 Lacticin LLC518
• 2.2.11 硫酸铵沉淀法及 pH 吸附法分离效果的检测
• 2.2.11.1 凝胶层析
• 2.2.11.2 离子交换层析
• 2.2.11.3 疏水层析
• 2.2.12 乳酸乳球菌素 Lacticin LLC518 的纯化
• 2.2.12.1 pH 吸附样品的纯化
• 2.2.12.2 硫酸铵沉淀样品的纯化
• 2.2.12.3 Tricine-SDS-PAGE
• 2.2.13 乳酸乳球菌素 Lacticin LLC518 的大规模制备
• 2.2.13.1 乳酸乳球菌素 Lacticin LLC518 的膜过滤
• 2.2.13.2 排除辅料的干扰
• 2.2.13.3 乳酸乳球菌素 Lacticin LLC518 喷雾干燥条件的优化
• 2.2.14 乳酸乳球菌素 Lacticin LLC518 的毒理学特性检测
• 2.2.14.1 半数致死量（LD50）的检测
• 2.2.14.2 最大耐受量的测定
• 3 结果与分析
• 3.1 Lowery 法测蛋白浓度标准曲线
• 3.2 Lacticin LLC518 的 pH 稳定性
• 3.3 Lacticin LLC518 的作用方式
• 3.3.1 作用方式
• 3.4 乳酸乳球菌 LLC518 的生理曲线
• 3.5 pH 对乳酸乳球菌素 Lacticin LLC518 吸附与解吸附的影响
• 3.5.1 缓冲液的抑菌作用
• 3.5.2 吸附细胞的制备
• 3.5.3 离心机转速的设定
• 3.5.4 pH 对乳酸乳球菌素 Lacticin LLC518 吸附性的影响
• 3.6 硫酸铵沉淀样品及 pH 吸附样品的分析
• 3.6.1 凝胶层析（Sephadex G-50）
• 3.6.2 离子交换层析（DEAE Sepharose Fast Flow）
• 3.6.3 疏水层析
• 3.7 乳酸乳球菌素 Lacticin LLC518 的纯化
• 3.7.1 pH 吸附样品的纯化
• 3.7.1.1 RP-HPLC
• 3.7.1.2 Lacticin LLC518 的纯化表
• 3.7.1.3 Tricin-SDS-PAGE 电泳检测
• 3.7.2 硫酸铵沉淀样品的纯化
• 3.7.2.1 制备型 RP-HPLC
• 3.7.2.2 分析型 RP-HPLC
• 3.7.2.3 硫酸铵沉淀样品的纯化表
• 3.7.2.4 LC-MS 分析
• 3.7.2.5 MALDI-TOF-TOF-MS 分析
• 3.8 不同分离方法对于 Lacticin LLC518 的分离效果
• 3.9 乳酸乳球菌素 Lacticin LLC518 喷雾干燥条件的优化
• 3.9.1 辅料对乳酸乳球菌素 Lacticin LLC518 品质的影响
• 3.9.2 辅料对 Lacticin LLC518 得率及活力的影响
• 3.9.3 进风温度对 Lacticin LLC518 得率及活力的影响
• 3.9.4 出风温度对 Lacticin LLC518 得率及活力的影响
• 3.9.5 风机对 Lacticin LLC518 得率及活力的影响
• 3.9.6 蠕动泵对 Lacticin LLC518 得率及活力的影响
• 3.9.7 Plackett-Burman 实验
• 3.9.8 Box-Benhnken 实验
• 3.9.9 模型的验证
• 3.10 乳酸乳球菌素 Lacticin LLC518 的毒理学特性
• 4 讨论
• 4.1 乳酸乳球菌素 Lacticin LLC518 的 pH 稳定性
• 4.2 乳酸乳球菌素 Lacticin LLC518 的吸附性
• 4.3 乳酸乳球菌素 Lacticin LLC518 的纯化
• 4.4 乳酸乳球菌素 Lacticin LLC518 的制备
• 5 结论
• 参考文献
• 附录 A 喷雾干燥样品图
• 附录 B 喷雾干燥样品抑菌作用图
• 致谢
• 个人简介
• 硕士期间的研究成果