兔出血症病毒VP60蛋白与膜突蛋白相互作用的鉴定

论文摘要

兔出血症（Rabbit hemorrhagic disease, RHD）是由兔出血症病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus, RHDV）引起的危害3月龄以上青年兔和成年兔的一种急性、烈性、高度接触性传染病。该病于1984年在中国首次报道后,在世界各地相继发生。迄今,RHD已成为兔的一种毁灭性传染病,给养兔业带来了巨大的经济损失。从1984年RHD首次报道至今,关于RHDV的研究已经取得了很大的发展,但国内外的研究学者至今仍未发现一株能进行RHDV稳定繁殖的细胞系,故而就缺少一个可以从分子水平研究病毒的技术平台,这严重阻滞了对RHDV的研究,因此,RHDV致病的分子机理至今仍不十分清楚。在RHD的发生发展过程中,肝脏是病毒增殖的主要器官。临床病理解剖中肝脏的病理变化最为严重,并且在RHDV大量制备纯化的方案中,病死兔的肝脏往往是病毒的重要来源,研究者直接取肝脏匀浆后提取病毒,所以从肝脏细胞出发,寻找与RHDV相互作用的细胞表面蛋白具有重要意义,现已有研究证实RHDV可感染原代兔肝脏细胞。VP60是RHDV的主要衣壳蛋白,研究表明VP60蛋白与RHDV的致病性和免疫原性有着密切关系,故研究能与VP60蛋白相互作用的兔肝细胞表面蛋白,对了解RHDV致病的分子机制以及RHD的防控具有重要意义。本研究拟采用SMART技术,将兔肝脏cDNA定向克隆到pEXP-Lib载体中,构建兔肝脏细胞的真核表达文库。采用表达克隆法筛选文库,以纯化的VP60为诱饵蛋白,从真核表达文库中筛选能与VP60蛋白发生相互作用的蛋白。通过免疫共沉淀试验、血凝抑制试验,体外验证蛋白之间的相互作用;借助激光共聚焦试验技术证明蛋白在细胞内的共定位。实验结果表明,兔肝脏细胞真核表达文库的鉴定结果显示插入片段分布在0.3 kb 2.0kb之间,重组率约为86%,表明获得了高质量的兔肝脏细胞真核表达文库。筛选结果显示有26个EST片段与兔功能基因有较高的同源性,序列分析以及对蛋白的功能性分析,膜突蛋白（Moesin）可与VP60发生相互作用,故对Moesin进行进一步的相互作用验证以及功能性研究。以兔肝脏cDNA为模板,扩增Moesin部分片段基因688nt2157nt,分别连接到载体pET-30a和pEGFP-N1上,构建Moesin的原核表达载体pET-30a-Msn和真核表达载体pEGFP-N1-Msn。将pET-30a-Msn重组表达载体转化E.coli感受态细胞,诱导表达并纯化获得可溶性Moesin蛋白,通过免疫共沉淀试验和血凝抑制试验验证Moesin与VP60的相互作用。同时,将pEGFP-N1-Msn与pcDNA3.1-VP60重组表达载体共转染HEK293T细胞,采用激光共聚焦试验技术对Moesin与VP60在细胞内的共定位进行分析,证明了Moesin与VP60在哺乳动物细胞内能够通过相互作用达到共定位。本研究通过表达克隆法从兔肝细胞真核表达文库中筛选到Moesin基因,并在体外成功表达了Moesin部分片段基因,证明了其与RHDV VP60蛋白之间存在相互作用,为RHDV致病机理的研究奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 概况
• 1.2 病原学
• 1.2.1 病毒学分类与结构特性
• 1.2.2 理化特性
• 1.2.3 基因组结构
• 1.2.4 基因编码蛋白及功能研究
• 1.3 临床症状与病理变化
• 1.3.1 临床症状
• 1.3.2 病理变化
• 1.4 流行病学特性
• 1.5 诊断方法
• 1.5.1 电镜观察法
• 1.5.2 血凝和血凝抑制试验
• 1.5.3 酶联免疫吸附试验
• 1.5.4 反转录-聚合酶链式反应
• 1.6 防控
• 1.7 蛋白与蛋白相互作用研究的相关技术
• 1.7.1 酵母双杂交系统
• 1.7.2 免疫共沉淀技术
• 1.7.3 噬菌体展示技术
• 1.7.4 串联亲和纯化技术
• 1.8 膜突蛋白的研究进展
• 1.9 兔出血症病毒相互作用蛋白的研究进展
• 1.10 本研究的目的及意义
• 第二章 兔肝脏CDNA 文库中VP60 相互作用蛋白的筛选
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 菌株与细胞
• 2.1.2 实验动物
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 主要试剂
• 2.1.5 兔肝脏总RNA 的提取
• 2.1.6 兔肝脏cDNA 真核表达文库的构建
• 2.1.7 兔肝脏cDNA 真核表达文库的质量鉴定
• 2.1.8 转染用cDNA 文库重组质粒的制备
• 2.1.9 SP2/0 细胞的嘌呤霉素MLD 的测定
• 2.1.10 兔肝脏cDNA 文库重组质粒转染细胞试验
• 2.1.11 细胞筛选试验
• 2.1.12 重组质粒特异表达序列的鉴定
• 2.2 结果
• 2.2.1 兔肝脏总RNA 的含量及纯度
• 2.2.2 ds cDNA 的鉴定
• 2.2.3 文库质量的鉴定
• 2.2.4 SP2/0 细胞的嘌呤霉素最小致死浓度的测定
• 2.2.5 筛选的阳性SP2/0 细胞中重组表达质粒的PCR 鉴定
• 2.2.6 重组表达质粒的序列分析
• 2.3 讨论
• 2.3.1 兔肝脏cDNA 真核表达文库的构建
• 2.3.2 兔肝脏cDNA 真核表达文库的筛选
• 第三章 VP60 与膜突蛋白相互作用的验证
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 病毒、菌株、质粒、抗体、细胞
• 3.1.2 试剂与药品
• 3.1.3 主要仪器
• 3.1.4 Moesin 部分片段基因的克隆与表达
• 3.1.5 RHDV 的纯化
• 3.1.6 VP60 与Moesin 相互作用的免疫共沉淀验证
• 3.1.7 VP60 与Moesin 相互作用的血凝抑制试验验证
• 3.1.8 VP60 与Moesin 相互作用的细胞内共定位验证
• 3.1.9 Moesin 介导RHDV 进入细胞的初步探索
• 3.2 结果
• 3.2.1 Moesin 部分片段基因的克隆
• 3.2.2 Moesin 部分片段基因的表达与纯化
• 3.2.3 RHDV 的纯化
• 3.2.4 VP60 与Moesin 相互作用的免疫共沉淀验证结果
• 3.2.5 VP60 与Moesin 相互作用的血凝抑制试验验证结果
• 3.2.6 Moesin 真核表达载体的构建
• 3.2.7 VP60 真核表达载体的构建
• 3.2.8 VP60 在 HEK293T 细胞内表达的 IFA 分析结果
• 3.2.9 VP60 在 HEK293T 细胞内表达 Western blot 分析结果
• 3.2.10 激光共聚焦显微镜观察 VP60 与 Moesin 的细胞内共定位结果
• 3.2.11 Moesin 介导 RHDV 进入细胞的初步探索结果
• 3.3 讨论
• 3.3.1 Moesin 部分片段基因的克隆与表达
• 3.3.2 VP60 与 Moesin 相互作用的验证
• 第四章 结论
• 参考文献
• 附录 Ⅰ
• 附录 Ⅱ
• 附录 Ⅲ
• 致谢
• 作者简历