I型鸭肝炎病毒中国流行株生物学特性相关研究

论文摘要

鸭肝炎病毒（Duck hepatitis virus, DHV）是引起鸭病毒性肝炎（Duck viral hepatitis, DVH）的病原,该病毒可分为3个血清型,即DHV-1、DHV-2和DHV-3,这3个血清型之间无血清学交叉反应,其中DHV-1分为A、B和C3个基因型,DHV-1在世界范围内流行和分布,是严重危害养鸭业的重要病原,造成了巨大的经济损失。本研究以DHV-1流行病学调查为切入点,收集和采集了2003-2010年中国主要的养鸭地区,包括山东、广东、北京、福建、江苏和云南等省市110多个养殖场鸭的肝脏病料,通过接种9-11日龄SPF鸭胚,接种后72h内收集尿囊液并盲传3代以上,观察接种胚体的病理变化,结合基因鉴定等方法,分离到16株DHV-1病毒。大多数DHV-1病毒阳性病料接种鸭胚后,第一代或第二代鸭胚就会出现明显病变,表现为全身出血、发育受阻、胚死亡等病理变化,且鸭胚尿囊液对鸡外周血红细胞没有凝集活性,表明尿囊液中不含能够凝集鸡血红细胞的禽正粘病毒、副粘病毒等。为进一步了解中国DHV-1的分子特征、基因遗传演化特征以及不同基因型病毒的分布,本研究通过对GenBank上发表的其他毒株基因组序列进行比对,在保守区设计6对引物,同时应用3′端扩增技术和RT-PCR的方法获得了这16株DHV-1病毒的全部基因组序列。结果发现,16株病毒的基因组全长在7702nt到7761nt之间。由于DHV-1病毒为小RNA病毒科中未分类病毒,因此本研究首先利用全基因组遗传发育分析将分离到的16株病毒与小RNA病毒科其它7个病毒属的14株病毒进行比较,发现本研究分离到的DHV-1与其他小RNA病毒具有较远的遗传关系,提示DHV-1应该划分为小RNA科内的一个新属。在此基础上,本研究将16株DHV-1病毒与64株DHV-1参考毒株进行了系统发育进化比较,表明DHV-1可分为A、B和C 3个基因型,与已报道结果一致。本研究分离到的16个毒株中,13个属于基因A型,另外3个为基因C型。本研究未分离到基因B型DHV-1病毒。在对DHV-1基因组序列比较分析时发现,基因C型成员基因组略长于基因A型病毒基因组,分别在VP1基因和3`UTR内有插入。同一基因型内的DHV-1病毒序列同源性在90%以上,而不同基因型病毒序列同源性不足80%。为研究DHV-1对鸭的致病性,本研究选择基因A型病毒Du/CH/LBJ/090809作为代表毒株对雏鸭进行攻毒试验。结果显示该毒株对SPF雏鸭的致死率为30%,攻毒24h后部分雏鸭开始死亡,死亡鸭的病变部位主要集中在肝脏,表现为肝脏肿大、出血及坏死等;同时伴有脾脏和胆囊肿大等病理变化。此外,本研究通过原核表达系统获得了Du/CH/LBJ/090809病毒的7个重组蛋白以建立ELISA检测方法,通过比较筛选,发现重组的VP0和VP1-2蛋白免疫原性较好,而且具有较好的重复性,可以作为检测抗原。以此作为包被抗原,建立ELISA抗体检测方法,发现Du/CH/LBJ/090809感染后的雏鸭第8天开始发生血清阳转,12天达到高峰,32天之内抗体仍为阳性。为了进行DHV-1的鸡胚适应,以便为疫苗研制等奠定基础,本研究通过9-11日龄鸡胚系列传代,成功将Du/CH/LBJ/090809适应鸡胚。发现第29代（P29）病毒能够稳定地在鸡胚中繁殖并致鸡胚典型病变,利用该鸡胚传代适应毒株接种雏鸭,发现其对SPF雏鸭不产生致病作用。继续传至第40代（P40）进行雏鸭的接种和亲本强毒的攻毒试验,发现该病毒不但不引起雏鸭发病,而且能对亲本强毒的攻击提供了良好的保护性。表明该毒株具有疫苗研制的良好性能。为了进一步说明鸡胚适应和致弱过程在基因组水平的体现,本研究对P16、P29和P40的基因组与其亲本毒基因组进行比较分析,结果显示,病毒在适应鸡胚过程中,病毒基因组发生了明显变化,主要表现为核苷酸的突变及其导致的氨基酸的替代,突变的主要位点位于L、VP1、2C和3D蛋白。在以上研究基础上,本研究以弱毒株Du/CH/LBJ/090809 P40基因组为基础,进行基因点突变的分子修饰,构建了cDNA全长的感染性分子克隆,通过体外转染BHK细胞后,将细胞液在SPF鸡胚连续盲传,对传代至第4代时对鸡胚的致病性、分子Marker的鉴定均表明已成功拯救得到重组病毒粒子。这将为DHV-1的遗传进化、致病机理、基因功能等相关研究奠定基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 鸭病毒性肝炎概述
• 1.1.1 分类与分布
• 1.1.2 病原学
• 1.1.3 流行病学
• 1.2 Ⅰ型鸭病毒性肝炎概述
• 1.2.1 病原学
• 1.2.2 基因组结构
• 1.2.3 DHV-1 的致病性及其流行
• 1.2.4 诊断学
• 1.2.5 预防与控制
• 1.3 反遗传学概述
• 1.3.1 正链RNA 病毒的反遗传学
• 1.3.2 负链RNA 病毒的反遗传学
• 1.3.3 双链RNA 病毒的反遗传学
• 1.3.4 反遗传学在鸭肝炎病毒研究中的应用前景
• 1.4 研究目的和意义
• 第二章 中国Ⅰ 型鸭肝炎病毒的分离及其基因组分子特征
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 病料收集及毒株背景
• 2.1.2 鸭胚及红细胞的制备
• 2.1.3 载体及菌株
• 2.1.4 试剂
• 2.1.5 主要仪器
• 2.1.6 病料的处理
• 2.1.7 病毒的增殖
• 2.1.8 红细胞凝集试验
• 2.1.9 引物
• 2.1.10 病毒基因组RNA 的提取
• 2.1.11 反转录聚合酶链式反应
• 2.1.12 PCR 产物鉴定及其回收
• 2.1.13 感受态细胞的制备
• 2.1.14 PCR 产物连接与转化
• 2.1.15 重组质粒提取、鉴定及序列测定
• 2.1.16 序列测定及基因序列的确定及分析
• 2.2 结果
• 2.2.1 DHV-1 分离毒株致鸭胚病变情况
• 2.2.2 各分离株尿囊液对鸡外周血红细胞的凝集活性
• 2.2.3 DHV-1 分离株基因组序列的确定
• 2.2.4 16 株分离株基因组分析
• 2.2.5 各分离株编码的多聚蛋白切割位点预测
• 2.2.6 各分离株编码的多聚蛋白功能性位点预测
• 2.3 讨论
• 第三章 Du/CH/LBJ/090809 病毒致病性研究及其血清学ELISA 检测方法的建立
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 病毒及实验动物
• 3.1.2 菌株与载体
• 3.1.3 酶类及主要生化试剂
• 50 的测定'>3.1.4 Du/CH/LBJ/090809 毒株EID₅₀的测定
• 3.1.5 攻毒试验
• 3.1.6 攻毒后不同时间血清样品采集及收集
• 3.1.7 鸭抗Du/CH/LBJ/090809 阳性血清的制备及其中和活性
• 3.1.8 血清学检测方法的建立
• 3.2 结果
• (500 的测定及其致病性'>3.2.1 Du/CH/ LBJ/090809 EID₍500 的测定及其致病性
• 3.2.2 鸭抗Du/CH/LBJ/090809 阳性血清的制备及其中和活性
• 3.2.3 超离Du/CH/LBJ/090809 病毒ELISA 最佳工作浓度的确定
• 3.2.4 Du/CH/ LBJ/090809 病毒部分结构和非结构基因的扩增
• 3.2.5 Du/CH/ LBJ/090809 病毒部分结构和非结构基因重组表达质粒的鉴定
• 3.2.6 Du/CH/ LBJ/090809 病毒重组部分结构和非结构蛋白的获得
• 3.2.7 部分重组结构和非结构蛋白与鸭抗DHV-1 阳性和阴性血清的反应性
• 3.2.8 Du/CH/LBJ/090809 攻毒后抗体水平的检测
• 3.3 讨论
• 第四章 Du/CH/LBJ/090809 病毒鸡胚适应及基因组变化规律研究
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 病毒鸡胚传代
• 4.1.2 鸡红细胞凝集试验
• 4.1.3 不同代次病毒尿囊液RT-PCR 检测
• 4.1.4 鸡胚适应毒P29 和P40 鸡胚稳定性试验
• 50 的测定'>4.1.5 鸡胚适应毒P29 和P40 EID₅₀的测定
• 4.1.6 鸡胚传代病毒对SPF 雏鸭的致病力
• 4.1.7 P40 病毒的灭活及乳化
• 4.1.8 P40 病毒免疫攻毒保护试验
• 4.1.9 鸡胚传代过程中不同代次鸡胚适应毒基因组获得
• 4.2 结果
• 4.2.1 Du/CH/LBJ/090809 毒株鸡胚传代特征
• 4.2.2 各代次尿囊液对鸡外周血红细胞的凝集活性
• 4.2.3 不同代次病毒RT-PCR 检测
• 4.2.4 鸡胚适应毒P29 和P40 鸡胚稳定性试验
• 50 的测定'>4.2.5 鸡胚适应毒P29 和P40 EID₅₀的测定
• 4.2.6 亲本毒及鸡胚适应毒病毒滴度比较
• 4.2.7 鸡胚适应毒P29 和P40 对SPF 鸭的致病性
• 4.2.8 P40 病毒免疫攻毒保护试验
• 4.2.9 鸡胚传代过程中不同代次鸡胚适应毒基因组比较分析
• 4.3 讨论
• 第五章 Du/CH/LBJ/090809 传代致弱毒P40 感染性分子克隆构建及病毒拯救
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 细胞和毒株
• 5.1.2 载体与生化试剂
• 5.1.3 培养基
• 5.1.4 引物
• 5.1.5 RT-PCR
• 5.1.6 pACYC- P40 低拷贝质粒的构建
• 5.1.7 质粒的大量制备
• 5.1.8 体外转录
• 5.1.9 转染BHK 细胞
• 5.1.10 病毒拯救
• 5.2 结果
• 5.2.1 F1、F2、F3 片段的获得
• 5.2.2 pACYC-P40 低拷贝质粒的构建
• 5.2.3 病毒拯救
• 5.3 讨论
• 第六章 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历