（一）hsTRAIL蛋白的表达与复性研究 （二）重组枯草芽胞杆菌谷氨酰胺合成酶的诱导表达与培养基优化

论文摘要

为了获得有活性的hsTRAIL蛋白，本实验对hsTRAIL包含体进行了复性的研究。通过对hsTRAIL包涵体洗涤条件的研究，使蛋白纯度提高到90％以上，并确定了其简单适宜的复性方法，纯度达98％。采用稀释法可使得近65％的蛋白恢复可溶性，而透析法也能获得33％的可溶性蛋白。本实验中，我们对稀释复性的hsTRAIL蛋白进行了生物学活性的测定。结果显示：复性后的hsTRAIL蛋白能诱导Hela细胞凋亡，而对正常的人胚肾细胞293细胞无影响，实验结果与国外文献报道的结果相一致，表明复性后的hsTRAIL蛋白具有良好的生物学活性。以重组枯草芽孢杆菌谷氨酰胺合成酶（L-谷氨酸：氨连接酶，Glutamine Synthetase，GS EC 6．3．1．2）蛋白表达宿主菌株BE21（DE3）（2pET3C／谷氨酰胺合成酶）作为研究对象，借助SDS PAGE分析方法，对于用乳糖诱导由T7lac启动子控制的重组目的产物蛋白的各种基本参数进行了初步的研究。研究了最佳诱导起始生长量、最适诱导物浓度、诱导持续时间、补加乳糖和氨苄青霉素＼最佳本底培养基、最佳碳源及其最佳添加比例、碳源与诱导物的最适组合，并探索了适用于改良型培养基的诱导参数。实验结果表明，对于重组目的产物蛋白，改良型M9培养基完全可以替代LB培养基；以甘油为碳源，可以避免葡萄糖对了T7lac启动子的屏蔽作用。以乳糖为诱导物，目的蛋白的表达量、可溶性及酶活与以IPTG为诱导物基本接近。研究结果为酶法合成谷氨酰胺的工业化生产提供了一定的参考。

论文目录

• 第一部分 hsTRAIL蛋白的表达与复性研究
• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1 TRAIL的结构和分布
• 2 TRAIL受体
• 2.1 TRAILR1
• 2.2 TRAILR2
• 2.3 TRAILR3
• 2.4 TRAILR4
• 2.5 OPG
• 3 TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡的机制
• 3.1 受体途径
• 3.2 转录因子途径
• 3.3 核受体途径
• 3.4 线粒体与细胞凋亡
• 4 TRAIL在肿瘤治疗方面的价值
• 4.1 TRAIL与多重抗药性
• 4.2 TRAIL与传统放疗、化疗的协同作用
• 5 TRAIL作用的毒性反应
• 6 展望
• 实验研究
• 前言:
• 1 实验材料
• 1.1 菌种和质粒
• 1.2 试剂和耗材
• 1.3 主要实验仪器
• 2 实验方法
• 2.1 重组蛋白在大肠杆菌中的表达
• 2.1.1 表达质粒的转化
• 2.1.2 pET3c/hsTRAIL表达载体宿主菌的诱导表达
• 2.1.3 表达产物分布的确定
• 2.2 hsTRAIL包含体蛋白的漂洗纯化
• 2.3 包含体的溶解与复性
• 2.3.1 稀释复性:
• 2.3.2 透析复性:
• 2.4 复性hsTRAIL蛋白的浓缩
• 2.5 复性hsTRAIL蛋白的凝胶过滤纯化
• 2.6 复性hsTRAIL蛋白的生物学活性测定
• 2.6.1 hsTRAIL蛋白对293细胞作用的观察
• 2.6.2 MTT法测定hsTRAIL对Hela细胞的影响
• 2.6.3 DNA-Ladder法测定hsTRAIL对细胞的影响
• 3 实验结果
• 3.1 pET3c/hsTRAIL表达载体宿主菌的诱导表达
• 3.2 TRAIL包涵体蛋白的分离、漂洗和纯化
• 3.3 TRAIL包涵体的溶解与稀释复性
• 3.4 复性hsTRAIL蛋白的凝胶过滤纯化
• 3.5 复性hsTRAIL蛋白的生物学活性测定
• 3.5.1 hsTRAIL蛋白对293细胞作用的观察
• 3.5.2 MTT法测定hsTRAIL对Hela细胞的影响
• 3.5.3 DNA-Ladder法测定hsTRAIL对Hela细胞的影响
• 4 讨论
• 5 参考文献:
• 第二部分 重组枯草芽胞杆菌谷氨酰胺合成酶的诱导表达与培养基优化
• 摘要
• Abstract
• 前言
• 一 谷氨酰胺
• （一） L-谷氨酰胺的一般物化性质
• （二） 谷氨酰胺的代谢与生理功能
• （1） 谷氨酰胺的代谢
• （2） 谷氨酰胺的生理功能
• （三） 谷氨酰胺与免疫系统
• （四） L-谷氨酰胺的生产方法
• （1） 化学酰化法生成L-谷氨酰胺
• （2） 发酵法生成L-谷氨酰胺
• （3） 酶法生成L-谷氨酰胺
• （五） L-谷氨酰胺的生产概况
• （六） L-谷氨酰胺的前景展望
• 二 谷氨酰胺合成酶
• （一） 总述
• （二） 枯草芽胞杆菌GS
• 参考文献
• 实验研究
• 第一章 乳糖诱导重组枯草芽孢杆菌谷氨酰胺合成酶基因在大肠杆菌中的表达
• 1 实验材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 菌种和质粒
• 1.1.2 试剂和耗材
• 1.1.3 主要实验仪器
• 1.1.4 试剂配制
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 菌体生长及目的蛋白表达量的测定方法
• 1.2.2 菌株最佳诱导起始生长量的确定
• 1.2.3 最适诱导物浓度的确定
• 1.2.4 乳糖最佳诱导时间的研究
• 1.2.5 补加乳糖和氨苄青霉素对目的蛋白表达量的影响
• 1.2.6 不同培养基对目的蛋白表达的影响
• 1.2.7 表达产物分布的确定
• 1.2.8 表达产物活性的鉴定
• 2 结果
• 2.1 菌株最佳诱导起始生长量的确定
• 2.2 最适诱导物浓度的确定
• 2.3 乳糖最佳诱导时间的研究
• 2.4 补加乳糖和氨苄青霉素对目的蛋白表达量的影响
• 2.5 不同培养基对目的蛋白表达的影响
• 2.6 表达产物的分布
• 2.7 表达产物的活性
• 3 讨论
• 4 参考文献
• 第二章 重组枯草芽孢杆菌谷氨酰胺合成酶蛋白在改良M9培养基中的诱导表达
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 菌种和质粒
• 1.1.2 试剂和耗材
• 1.1.3 主要实验仪器
• 1.1.4 试剂配制
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 菌体生长及目的蛋白表达量的测定方法
• 1.2.2 菌株最佳本底培养基的确定
• 1.2.3 最佳碳源的确定
• 1.2.4 碳源最佳添加比例的确定
• 1.2.5 碳源与诱导物浓度组合的确定
• 1.2.6 不同温度对目的蛋白表达的影响
• 1.2.7 表达产物分布的确定
• 1.2.8 表达产物活性的鉴定
• 2 结果
• 2.1 菌株最佳本底培养基的确定
• 2.2 最佳碳源的确定
• 2.3 碳源最佳添加比例的确定
• 2.4 碳源与诱导物浓度组合的确定
• 2.5 不同温度对目的蛋白表达的影响
• 2.6 表达产物的分布
• 2.7 表达产物的活性
• 3 讨论
• 4 参考文献
• 致谢