稳定融合表达拮抗Aβ1-42肽细胞内毒性的适配子策略及其作用机制的研究

论文摘要

随着生命科学理论发展和方法学的不断进步,蛋白质的许多具有特殊生物学活性的结构如短肽研究也取得了可喜的进展。在浩瀚的科技文献中,每天都有关于生物活性肽生物学功能和意义的新发现。尽管如此,但由于生物性肽体内半衰期短,水溶液稳定性差和人工合成昂贵等问题,迄今少有研究可以解决将生物活性肽应用于疾病的诊断、治疗和预防,致使大量关于生物活性肽的研究“沉睡”在科技文献之中。本研究构建了携带融合基因TRX-ABAD-DP（TA）的慢病毒载体,实现了在细胞内稳定表达可溶性适配子TA,通过体外Aβ1-42（Aβ42）肽段和过氧化氢（H2O2）的细胞学实验证实了可表达适配子TA的重组慢病毒具有较强的神经保护作用,而融合人硫氧化还原蛋白1（hTRX）表达胞浆可溶性适配子的策略可能成为将生物短肽用于中枢神经系统疾病治疗的又一新途径。为了实现以上目的和证实神经保护作用,本研究进行了以下实验:1、构建真核表达hTRX-ABAD-DP融合基因（TA）的重组慢病毒。2、建立Aβ转基因细胞模型利用逆转录病毒载体,在PC12细胞内表达突变β淀粉样肽Aβ42肽段基因。3、通过体外Aβ转基因细胞模型实验验证可表达适配子TA的重组慢病毒具有神经保护作用。4、利用H2O2毒性实验验证融合适配子可能存在的神经保护作用。5、根据适配子TA的氨基酸序列利用PyMol软件推测TA的三级结构,探讨该表达短肽策略的理论可行性。主要研究结果及结论:①基因测序和琼脂糖凝胶电泳结果证实融合基因正确插入pLenti6/V5TOPO,表达适配子TA的重组慢病毒能够高效的转染PC12细胞。②MTT和流式细胞检测结果表明在Aβ转基因模型细胞中表达TA的重组慢病毒,能够明显增加Aβ转基因细胞数量,改善其活力,减少细胞的凋亡和坏死,说明重组病毒表达的蛋白能对阿尔茨海默病（Aizheimer病,AD）细胞模型起到保护作用。③在H2O2毒性实验中,表达TA的重组慢病毒亦具有类似TRX的明显抗活性氧簇,细胞保护作用。④hTRX可能参与早期由细胞内Aβ42引起的氧化还原失衡状态,而适配子TA可以有效调节该种失衡,起到神经保护作用。本实验证实了hTRX融合修饰ABAD阻断肽后,可达到稳定该短肽生物学活性、协助短肽的正确折叠、保证细胞胞浆靶向性的目的;与此同时,结果显示适配子中的hTRX构成部分可以保持抗活性氧簇的特性,在减轻细胞内Aβ神经毒性作用方面起到协同ABAD阻断肽的作用。本研究针对Aβ细胞内中毒学说,提出了一种新的CNS疾病基因治疗方法,这将为修饰其它功能肽类物质进入脑组织提供新的思路和方法,为基因治疗CNS疾病（例如AD）带来新的希望。

论文目录

• 提要
• 中英文缩略词表
• 第一章 文献综述
• 42肽毒性研究进展'>一、细胞内Aβ₄₂肽毒性研究进展
• 二、适配子治疗的研究进展
• 第二章 实验方法与结果
• 一、构建分泌表达TRX，rABAD 和TA 的重组慢病毒
• 二、pLent/hTRX，rABAD 和TA 对细胞内Aβ42肽的细胞保护作用
• 三、pLent/TA 神经保护作用机制的研究
• 第三章 讨论
• 一、肽类药物临床应用的新途径---细胞内融合稳定神经保护适配子策略
• 二、适配子TA 的作用机制探讨
• 三、本研究的特色与创新
• 四、展望
• 结论
• 附图
• 参考文献
• 攻博期间发表的论著、参与的科研项目及获奖情况
• 中文摘要
• 英文摘要
• 致谢