鬼臼毒素固体脂质纳米粒冻干粉和凝胶的制备及其理化性质考察

论文摘要

背景尖锐湿疣（condyloma acuminatum,CA）是由人类乳头瘤病毒（humanpapilloma virus,HPV）感染引起的临床常见性传播疾病,目前仅次于淋病位居我国性传播疾病的第二位。CA具有高复发特性,且部分可转化为鳞癌或宫颈癌,因此CA已成为危害人类健康不可忽视的问题。鬼臼毒素（podophvllotoxin,PPT）是从鬼臼树脂类木脂素中分离得到的具有显著细胞毒性的天然活性物质。0.5%鬼臼毒素酊剂是WHO推荐治疗CA最有效的一线药物之一,因存在对皮肤刺激性较大、作用时间短、对HPV潜伏感染难以凑效、缺乏良好的皮肤靶向性及大面积使用易产生吸收毒性等不足而限制了其在临床进一步应用。固体脂质纳米粒（solid lipid nanoparticles,SLN）是近年皮肤靶向性药物载体研究的热点,被认为是可替代脂质体的新一代药物载体。SLN制剂局部给药具有生理相容性好、可控制药物释放、良好的靶向性、可避免化学不稳定性药物的降解和减少药物对皮肤的刺激作用等多项优点,因此,固体脂质纳米粒作为药物载体应用于经皮给药系统具有良好的发展前景。我们以毒性低、生物相容性好的固体脂质材料—硬脂酸、十八烷酰胺为药物载体吸附或包裹PPT,以Brij78和大豆卵磷脂为混合表面活性剂,采用改良的乳化蒸发-低温固化法研制了鬼臼毒素固体脂质纳米粒（PPT-SLN）混悬液。然而,PPT-SLN混悬液具有不稳定性,室温下长期贮存会产生水解、结晶、絮状沉淀等现象。为了提高PPT-SLN的稳定性,我们研制了PPT-SLN冻干粉和凝胶,对其制备工艺进行初步考察,并考察其局部用药特点。目的1、探讨PPT-SLN冻干粉和凝胶的制备工艺。2、考察PPT-SLN冻干粉的理化性质。3、考察PPT-SLN凝胶的皮肤靶向性和缓释性。方法1、采用改良的乳化蒸发—低温固化制备PPT-SLN混悬液,在混悬液基础上加用冻干保护剂,冻干配方为15%海藻糖、15%甘露醇和二者联用各取5%,冷冻干燥制作冻干粉制剂。制备含有1%卡波姆的PPT-SLN凝胶。2、透射电镜下观察冻干粉复溶后粒子形态,用Image-Pro Plus 6.0图象处理软件计算冻干保护剂两种状态下（海藻糖和甘露醇是否加用即2×2种组合）粒径大小,用高效液相色谱法测定固体脂质纳米粒中鬼臼毒素的包封率,并考察冻干粉的外观、复溶和4℃保存对其影响,评价不同辅料对冻干品的影响。3、取wistar大鼠28只,随机分为14组（即2×7种组合）,每组两只大鼠,腹部左右两侧各取两处皮肤做组织病理片,每张病理片经图象处理软件分析取出50个荧光强度值,考察指标为荧光强度值,即每组200个荧光强度值。药物组有两个水平,即PPT-SLN凝胶和PPT酊剂,时间组有7个水平,即0.5、1、2、4、8、16、32h。14组大鼠同一时间涂药,涂药后0.5、1、2、4、8、16、32h处死大鼠,取腹部两处各约1×1cm皮肤,用PBS溶液洗净所取皮肤上残留药物,不用福尔马林液固定,新鲜组织取材后迅速做组织病理-20℃冰冻切片,厚约4-6μm,不染色,不封片。共聚焦激光显微镜下观察药物不同时间点在皮肤各层次分布的荧光图,并将所得图像存盘,利用Image-Pro Plus 6.0图像处理软件计算荧光强度值,进行可视化定量分析,考察药物的皮肤作用特点。4、所得数据用（?）±S表示,利用SPSS13.0软件对冻干粉粒径和大鼠皮肤组织病理片强光强度值均采用析因设计方差分析法进行统计,多个水平组间比较用LSD法检验,两个水平组间比较采用独立样本t检验,P≤0.05时差异有统计学意义。结果1、制备的PPT-SLN混悬液为半透明、淡乳色、质地均匀和带淡蓝色乳光的胶体状分散体系。制备的PPT-SLN冻干粉:①海藻糖冻干粉:表面松脆多孔,疏松,边缘有部分萎缩。②海藻糖联用甘露醇冻干粉:表面松脆多孔,疏松,边缘网格状。③甘露醇冻干粉:表面较光滑,结构致密,饼状。制备的PPT-SLN凝胶为均匀、细腻、粘稠的乳白色半透明胶体。2、PPT-SLN冻干粉复溶情况:海藻糖冻干粉、海藻糖联用甘露醇冻干粉复溶较快,约需20s,甘露醇冻干粉复溶较慢,需借助外力。冻干粉样品4℃冰箱放置24 h、1,3,6个月其外观和复溶均无明显变化;电镜下粒子形态:呈圆形或椭圆形,分布较均匀,冻干前后外观无明显变化;粒径:未加冻干保护剂时为（82.65±18.41）nm,加入海藻糖、海藻糖联用甘露醇、甘露醇后分别为（94.78±19.76）,（109.26±16.15）,（114.63±21.42）nm,方差分析显示:是否加用海藻糖对冻干粉粒径的影响不具有统计学意义（F=1.802,P=0.181）,而是否加用甘露醇对冻干粉粒径的影响具有显著性（F=158.579,P=0.000）,二者的交互效应差异亦显著,海藻糖联用甘露醇和甘露醇单独使用两组间差异不具有统计学意义（t=1.442,P=0.152）,海藻糖单独使用与未加保护剂两组比较差异有统计学意义（t=3.560,P=0.001）。包封率:未加冻干保护剂时为87.4%,加入海藻糖、海藻糖联用甘露醇、甘露醇后分别为86.2%,80.3%,79.6%。3、PPT-SLN凝胶在0.5、1、2、4、8、16h的荧光值分别为10.77±1.71、27.27±2.52、29.26±3.74、40.80±5.88、110.53±18.69、8.50±1.20,同一时间点两组间比较P＜0.05,PPT酊剂在0.5、1、2、4、8、16h的荧光值分别为68.32±4.31、91.84±7.52、126.95±13.40、42.79±3.24、14.02±2.11。PPT酊剂在表皮内迅速分布,0.5、1、2、4h分别是PPT-SLN凝胶的6.34、3.36、4.34、1.05倍,凝胶剂分布较慢,然而8h凝胶是酊剂的7.88倍,16h仍有荧光。根据方差分析结果可知:不同药物间有显著差异（F=47.269,P=0.000）,用药后不同时间之间有显著差异（F=146.565,P=0.000）,两种组合的交互效应亦显著,交互效应轮廓图直观的表达了这一点。交互效应轮廓图更直观的表明了PPT酊剂在皮肤表皮2h达到高峰,4h药物浓度明显降低,而PPT-SLN凝胶在8h左右表皮内分布最多,随着时间的延长,其药物浓度逐渐降低。结论1、初步制备了PPT-SLN冻干粉和凝胶,其外观性状较为理想。2、海藻糖是较好的冻干保护剂,据此制备的PPT-SLN冻干粉粒径较小,包封率高,稳定性好,其制备工艺合理可行。3、PPT-SLN凝胶和PPT酊剂在表皮的分布差异具有具有显著性,PPT-SLN凝胶具有较好的表皮靶向性和缓释作用,可持续到32h之前。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 鬼臼毒素固体脂质纳米粒冻干粉和凝胶的制备
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.3 结果
• 1.4 讨论
• 第二章 鬼臼毒素固体脂质纳米粒冻干粉的理化性质考察
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 第三章 鬼臼毒素固体脂质纳米粒凝胶的皮肤靶向性考察
• 3.1 材料
• 3.2 方法
• 3.3 结果
• 3.4 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 附图
• 英文缩写词对照表
• 循证综述
• 成果
• 致谢