氟西汀对野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠P-选择素表达的影响

论文摘要

氟西汀对野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠P-选择素表达的影响前言P-选择素（P-selectin）是存在于内皮细胞Weibel-Palade体和血小板a囊泡中的糖蛋白，细胞激活时迅速转移到膜上。促血栓形成状态可源于血液中高浓度的可溶性P-选择素。抑制P-选择素可以抑制血小板聚集，抑制P-选择素还可以抑制血栓形成。血栓形成是肺动脉高压（pulmonary hypertension，PH）时的主要表现，而P-选择素与肺动脉高压关系的研究报道很少。已有研究表明在原发性肺动脉高压（primary pulmonary hypertension，PPH）时血浆P-选择素浓度增加，说明它可能在肺动脉高压的发生过程中起到一定的作用，但是在野百合碱性肺动脉高压中是否有变化还未研究过。野百合碱（monocrotaline，MCT）诱导的肺动脉高压是一种慢性炎症性肺动脉高压模型，许多生物活性因子参与了肺动脉高压的病理过程，如内皮素（endothelin）、5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ）等。有研究表明，野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠血浆中5-HT浓度升高，肺动脉平滑肌细胞5-羟色胺转运体（5-hydroxytryptamine transporter，5-HTT）mRNA表达增多，应用5-羟色胺转运体抑制剂氟西汀（fluoxetine，FLU）对低氧性肺动脉高压有一定的保护作用。氟西汀已被多次报道可以引起出血，而有抑制血栓形成的倾向，推测可能是由于抑制血小板聚集所致。而P-selectin是血小板激活的标志，那么氟西汀能抑制P-选择素的表达吗?本研究拟在MCT诱导的肺动脉高压大鼠和经氟西汀治疗的大鼠模型中，用ELISA法测定血浆中的P-selectin浓度，用Western blot测定肺组织中的P-selectin，以探讨其在肺动脉高压形成中的可能机制及其与5-HT的关系。实验材料和方法1．FLU对慢性炎症性肺动脉高压大鼠的作用雄性Wistar大鼠28只，随机分为四组，对照组、MCT组、氟西汀高剂量组、氟西汀低剂量组。MCT组和氟西汀组一次性腹腔注射MCT 60mg／kg。对照组注射同等量的溶剂。氟西汀高剂量组和低剂量组分别给予每天10mg／kg和2mg／kg氟西汀灌胃，对照组和MCT组用相同体积生理盐水每天灌胃一次。以上各组均常规饲养21天。用20％乌拉坦（5mg／kg）腹腔注射麻醉大鼠。剥离右颈动静脉，将微导管（PE-50）插入右颈动脉，将另一个微导管（PV-1）经右颈静脉插入右心室，经血液冲入肺动脉，并通过P23ID压力换能器连接多导生理记录仪（日本光电）测量并记录肺动脉压。开胸取出大鼠心脏，分离右心室（RV）、室中隔和左心室（LV+S），滤纸吸水后称重，计算右心室肥大指数：RV／LV+S。2．HE染色将5μm厚的大鼠肺动脉石蜡切片用HE（Hematoxylin and Eosin）染色，光学显微镜检测，测量外径在70-100μm的肺肌型小动脉中膜厚度，对肺肌型小动脉中膜厚度进行统计学分析。3．ELISA每只大鼠各取1.8ml血，用2％乙二胺四乙酸（EDTA）溶液0.2ml抗凝，3500rpm离心10分钟，取上层血浆按试剂盒说明检测P-选择素的浓度。4．Western blot取肺组织约100mg，剪碎，加入0.5ml蛋白裂解液，电动匀浆至无组织块残留。4℃离心，2000rpm，1min，取上清冰上孵育5min；4℃离心，5000rpm，10min。取上清，即为蛋白提取液。以BSA为标准品，用Bradford法测蛋白浓度，将样品煮沸5min后进行SDS-PAGE蛋白电泳，转移至PVDF膜，4℃封闭（5％脱脂牛奶）过夜；加一抗P-selectin（1：800稀释），水平摇床摇动2小时，PBS-T洗膜3次，每次10分钟；加二抗P-selectin（1：3000稀释），水平摇床摇动1小时，PBS-T洗膜3次，每次10分钟；ECL试剂盒中A、B试剂1：1混合均匀加于膜上，移入暗室，曝光30秒，显影5分钟，定影5分钟，水洗，晾干，将胶片上的图像输入AlphalmagerTM2002图像分析系统，应用ID Image Analysis Software进行表达强度测定，结果以IOD（Integral optical density）值表示。保存结果并进行半定量分析。5．统计学处理所有数据以平均值+／-标准差表示，采用单因素方差分析对组间差异进行统计学检验，P＜0.05时被认为有统计学差异。结果三周后，MCT组大鼠肺动脉压显著升高（MCT26.1±4.4，n=7 vs Vehicle 15.9±2.0，n=7 P＜0.05），右心肥大指数明显升高（MCT0.38±0.05，n=7 vs Vehicle 0.22±0.04 n=7 P＜0.05）。应用FLU处理后的大鼠肺动脉压显著降低（FLU2 20.5±3.7，n=7 vs MCT 26.1±4.4，n=7 P＜0.05；FLU10 19.2±3.6，n=7 vs MCT26.1±4.4，n=7P＜0.05）；三周后，MCT组大鼠的肺血管平滑肌层明显比对照组增厚（MCT 0.54±0.05，n=7 vs Vehicle 0.34±0.03，n=7 P＜0.05）应用FLU处理后的大鼠肺血管平滑肌层增厚减轻（FLU20.41±0.07，n=6 vs MCT 0.54±0.05，n=7 P＜0.05；FLU100.39±0.02，n=7 vs MCT 0.54±0.05，n=7 P＜0.05）；三周后，MCT组大鼠的血浆P-selectin水平显著升高（MCT42.8±6.1，n=7 vs Vehicle27.9±3.9，n=7 P＜0.05），应用FLU处理后的大鼠血浆P-selectin水平降低（FLU233.9±7.5，n=7 vs MCT42.8±6.1，n=7 P＜0.05；FLU10 33.2±1.8，n=7 vs MCT 42.8±6.1，n=7 P＜0.05）；三周后，MCT组大鼠的肺组织中P-selectin水平与正常组相比显著升高（P＜0.05），FLU可明显降低P-selectin蛋白表达水平（P＜0.05）。结论P-选择素可能与野百合碱诱导的炎症性肺动脉高压的发生有关，氟西汀对MCT诱导的肺动脉高压有一定的保护作用，其机制可能与抑制P-选择素的蛋白表达有关。

论文目录

• 一、摘要
• 中文论著摘要
• 英文论著摘要
• 二、英文缩略语
• 三、论文
• 前言
• 实验材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 四、本研究创新性的自我评价
• 五、参考文献
• 六、附录
• 综述
• 在学期间科研成绩
• 致谢
• 个人简介