论文摘要
背景视网膜色素变性（retinitis pigmentosa, RP）是视网膜变性中最常见的一组以进行性光感受器细胞及视网膜色素上皮功能丧失为共同表现的致盲性眼病,其具有高度的遗传和表型异质性。根据RP遗传方式的不同,可将其分为常染色体显性遗传RP （autosomal dominant RP, adRP）、常染色体隐性遗传RP（autosomal recessive RP, arRP）和X伴性连锁遗传RP （X-lined RP, XLRP）,少数表现为双基因突变遗传及线粒体遗传。当因缺乏家族史而无法确定其遗传方式时,则为散发型RP （sporadic RR,SRP）,大多数SRP表现为arRP。经统计,引起adRP、arRP、XLRP的突变基因分别有20、26、2种。RP是发达国家工作年龄中致盲的最普遍原因,全球RP的发病率约为1／3500,已超过100万人受累,但目前尚无有效的预防和治疗措施,而对RP致病基因的确立则可为探讨RP发病机制,进行遗传咨询、产前诊断及基因治疗创造条件。研究表明,与人类光感受器功能障碍或变性有关的基因座约有70多个,目前已发现53个基因座与RP有关,因此对RP致病基因的定位研究仍然是分子遗传学研究的热点。adRP是最常见的RP遗传方式,目前在已报道的53个基因座中,已确定19个与adRP有关,其中RHO、PRPF31、RP1、IMPDH1及RDS基因是引起adRP常见的突变基因。RHO与PRPF31基因是我国汉族RP人群中最常见的突变基因,但在白族人群中尚未见报道。至今,RHO基因已超过120种不同类型的突变被发现,在这些突变中,90%为单个碱基置换的点突变,一般突变范围不超过20个碱基对。研究发现,该基因突变存在种族差异,在欧美、日本、中国其突变所占adRP分别为25%、5.9%、7.7%,南美人群中最常见的RHO基因突变类型是Pro23His,而亚洲,所有已报道的RHO基因突变均集中在羧基末端（QVSPA）, Pro347Lue是该区域中最多见的突变热点,也是全球性的多发突变位点。PRPF31基因是仅次于RHO基因座的常见adRP基因,其最先是在一个英国adRP大家族通过连锁分析发现并将其定位在染色体19q13.4, PRPF31基因突变包括错义突变、缺失、插入及剪接位点的改变,目前已有30个不同位点的突变被发现,其较多见的突变位点位于外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子11及内含子与外显子交界处。据统计,在美国等西方国家RP1突变是较常见的,占所有RP的7%,其中以位于外显子4的错义突变（R677X）多见,在我国,其突变较少见。RDS突变可引起很多类型的视网膜变性,目前已发现超过70个RDS基因突变与adRP和常染色体显性黄斑变性（adMD）有关,其中引起adRP的突变位点仅占5%。RDS突变所致的adRP有地区差异,在美国及北欧较多见,在我国等亚洲国家较少见,RDS基因突变多位于外显子1。IMPDH1基因突变多见于外显子7,目前国内外对IMPDH1基因的突变报道尚不多,但其突变所致的adRP发病早,且严重。在这些已发现的RP基因座中大多数是通过家系连锁分析的方法定位的,连锁分析是一种成熟的基因定位克隆技术,90年代初Inglehearn、Greenberg等就利用短串联重复序列（short tandem repeat,STR）遗传标记进行连锁分析,分别在染色体7p、17P上发现了新的adRP致病基因,随后也相继有报道。该技术是其以二代或二代以上的家系材料为基础,利用人类基因组中存在的遗传标记进行分析,观察标记位点与疾病致病基因位点在家系内是否呈共分离,并计算出遗传距离及连锁程度,从而确定致病的候选基因。遗传病具有一定的家族遗传倾向,利用家系对遗传性疾病的研究是基因定位的一大特色,也是发挥我国人口资源优势的一大特色。RP致病基因的突变是多种多样的,特别是在不同地区、不同民族中,不同基因的突变可导致RP,相同基因的不同突变也可引起RP。白族是我国西南地区一个不同于汉族的少数民族,其世代迁移少,是相对封闭的种族,具有良好的单基因疾病遗传背景,对其致病基因的定位研究,将丰富我国RP基因的突变图谱,为创建我国RP人群遗传图谱及基因序列结构功能信息系统提供更多信息。研究目的确定该白族adRP家系的发病与RHO、PRPF31、RP1、RDS及IMPDH1基因的关系。方法1.基因分型在3号染色体RHO基因上下游选取相距1cM的2个短串联重复序列STR:D3S3606与D3S1292第二代遗传标记进行多重PCR反应,STR引物序列5’-端加FAM荧光标记,根据荧光标记,采用ABI公司3100测序仪读取STR等位基因片段大小,收集数据后用Gene Mapper version 3.5软件包进行处理。2.连锁分析和单倍型分析利用LINKAGE package 5.1软件包中的MLINK程序将每对引物与adRP家系致病基因位点进行两点连锁分析,根据下列标准判断遗传标记与疾病的连锁程度：LOD值≥+3,肯定连锁；LOD值≤-2,否定连锁；-2<LOD值<+3,则需增加样本量；家系图及单倍型分析由Cyrillic2.1软件绘制。3.测序利用Primer premier5.0软件设计引物,PCR产物纯化后上样,利用ABI PRISM（?）3100 Genetic Analyze测序仪对RHO基因第1-5外显子及外显子与内含子的交界处序列及PRPF31、RDS、IMPDH1基因多发突变位点的进行序列分析,测序结果与GenBank数据库中核酸序列进行比对。4.限制性内切酶反应全部家系成员的RHO基因第5号外显子PCR纯化产物加入限制性内切酶NlaIVI,消化后取样于非变性聚丙烯酰胺凝胶（native-PAGE）中进行电泳分析,从而从另一角度证实RHO第5号外显子的碱基变异。5.数据统计实验对研究中所发现的4个SNP位点：c.45G/A （rs7984）、c.70A/G （rs2269736）、（IVS6-78IVS6-75del4CACA, rs57960425）及IVS6-31C/T（rs2303557）上的基因型与等位基因频率进行列表统计。因样本容量太小且样本中个体之间不是相互独立的,故未做χ2检验及等统计分析。结果1.5代22名成员中13人已确诊为视网膜色素变性,其中8名男性5名女性。第Ⅳ代年龄9岁（Ⅳ6）,第Ⅴ代年龄6岁（V1）,目前均已出现夜盲症状,但眼底检查及电生理检查尚正常。该家系为常染色体显性遗传性视网膜色素变性,家系患者间症状相似,即自幼出现夜盲,随年龄的增长,双眼视力逐渐减退,晚期多出现后囊性白内障,眼底改变表现为：视盘色泽呈蜡黄,视网膜血管变细,视网膜后极部广泛的骨细胞样色素沉着,黄斑光反射存在,视网膜电图杆锥细胞振幅减低,甚至熄灭。患病成员中除了视网膜色素变性和白内障外,无其他眼科疾病,也无其他异常症状。2.对RHO基因进行两点连锁分析,结果显示当重组率θ=0时,D3S3606、D3S1292存在最大LOD值：3.61、4.55,其支持遗传标记D3S3606、D3S1292与该家系adRP疾病存在连锁；从单倍型分析中可见,D3S3606与D3S1292之间约的1 cM（里摩）区域与疾病呈共分离,因此提示该家系的致病基因可能在3号染色体上D3S3606与D3S1292之间相距1cM的区域,而该区域目前发现的唯一与adRP相关的致病基因是RHO。3.RHO基因序列分析结果发现所有adRP患者RHO基因第5号外显子347位密码子的第2碱基处均发生单个碱基替换（c.1040C>T）,该位点呈杂合型,其碱基的变异导致脯氨酸（Pro）变为亮氨酸（Leu）。此外,家系成员中RHO基因外显子1非编码区存在2个多态位点：c.45G/A（rs7984）,c.70A/G（rs2269736）,统计发现,61.54%（8／13）患者共表达AA（rs7984）.GG（rs2269736）基因型。而在PRPF31基因中,50%（11／22）家系成员存在PRPF31基因第6内含子4个碱基的缺失（IVS6.78IVS6.75del4CACA,rs57960425）,其中包括7例（53.8%）adRP患者和4例（44.4%）正常个体；50%（11／22）家系成员存在IVS6-31 C/T（rs2303557）变异,包括8例（61.5%）adRP患者和3例（33.3%）正常个体。RP1、RDS及IMPDH1基因的多发位点筛查未发现任何碱基变异。4.限制性内切酶反应显示,所有家系的RP患者经NlaIV酶消化后产生5个片段：307bp.177bp.130bp.50bp及43bp,而正常个体只有4个片段：177bp和130bp.50bp.43bp,因而进一步验证了RHO基因第5号外显子347位密码子的第2碱基处发生了改变,且该位点的突变与疾病呈共分离。结论1.PRPF31.IMPDH1及RDS基因多发位点的碱基变异与该白族家系的adRP发病无相关。2.RHO基因突变与该白族家系的致病基因存在连锁关系,其与adRP疾病呈共分离,所有家系患者均有RHO基因第5号外显子的错义突变（p.Pro347Leu）,该突变与其致病相关。3.RHO基因第1号外显子非编码区的两个SNP位点rs7984（AA）. rs2269736（GG）纯合基因型的共表达与p.Pro347Leu突变致病可能存在疾病关联性。
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