根癌农杆菌介导芜菁花叶病毒的Hc-Pro基因对茎用芥菜的遗传转化研究

论文摘要

本研究以茎瘤芥（Brassica juncea Coss.var.tumida Tsen et Lee）作为试验材料,分别以子叶和子叶诱导的愈伤组织为外植体,建立了农杆菌介导的芜菁花叶病毒Hc-Pro基因的转化体系,得到了茎瘤芥转基因植株。本研究不仅为利用现代病毒分子生物学和植物基因工程育种获得抗病毒农作物提供理论和技术依据,也为芥菜以及其他十字花科作物转基因技术提供技术平台。 主要结果归纳如下: 1.以子叶为外植体的基因转化体系的建立 茎瘤芥子叶可以在含有3 mg/L BA和0.5 mg/L NAA的培养基上得到95%以上的不定芽再生率。本论文研究了预培养时间（2d,3d,4d）、共培养时间（2d,3d,4d）和共培养温度（20℃,24℃,28℃）对子叶转化效率的影响;还对农杆菌、抗生素对子叶分化的影响进行了研究。结果表明,预培养3d的外植体在28℃共培养3d的条件下获得了最高的分化频率。经PCR鉴定,最高转化频率达16.34%。高浓度的农杆菌可以抑制子叶的分化,随着侵染子叶的农杆菌浓度(OD600)从0.1上升到0.3,子叶的分化频率下降了43个百分点。研究还发现,羧卞青霉素与头孢酶素都在一定程度上抑制了子叶不定芽的分化。 2.以愈伤组织为外植体的基因转化体系的建立 子叶切块可在含有0.25 mg/L NAA,0.25 mg/L 2,4-D和0.5 mg/L BA的MS培养基上被诱导成愈伤组织。本论文研究了外植体状态（不同继代次数）、共培养温度（20℃,24℃,28℃）和共培养时间（1d,2d,3d）对愈伤组织转化效率的影响;还对抗生素对愈伤组织分化的影响以及转化植株的遗传多样性进行了研究。结果表明,经2次继代的愈伤组织在24℃共培养2d的条件下获得了最好的转化频率,为3.95%。同时发现,羧卞青霉素与头孢霉素均对愈伤组织的分化有促进作用。RAPD分析表明转化植株存在遗传多样性。 3.转化植株的分子及抗病性鉴定 经PCR及Southern blot检测,目的基因及筛选标记基因已经插入了茎瘤芥染色体基因组中。经病毒接种鉴定及ELISA分析,转化植株较对照株获得了较好的抗性,虽然没有完全抗病,但可以在一定程度上延迟发病。

论文目录

• 目录
• ABBREVIATIONS
• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 文献综述
• 第一节 十字花科作物转基因研究进展
• 1 转化受体
• 2 转化方法
• 2.1 载体介导转化法
• 2.2 DNA直接导入转化
• 2.3 种质系统介导转化法
• 3 目的基因
• 4 最佳转化系统及最高转化频率
• 5 无选择标记基因转化
• 6 转基因存在的问题
• 7 前景
• 第二节 转基因植物抗病毒机理
• 第二章 以子叶为外植体进行HC-PRO基因的转化
• 1 材料与方法：
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 根癌农杆菌菌株及载体
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 子叶的组织培养再生途径
• 1.2.1.1 无菌苗的获得
• 1.2.1.2 外植体的获得及不定芽的诱导
• 1.2.1.3 不定芽的生长及生根
• 1.2.2 基因转化途径
• 1.2.2.1 外植体的预培养
• 1.2.2.2 工程菌液的准备及侵染
• 1.2.2.3 农杆菌与外植体共培养
• 1.2.2.4 筛选、分化及生根
• 1.2.2.5 培养基配制及培养条件
• 1.2.3 数据的处理
• 2 结果与分析
• 2.1 不定芽的诱导
• 2.2 除草剂对子叶分化及苗生长的影响
• 2.3 农杆菌对子叶的影响
• 2.4 抗生素对子叶分化的影响
• 2.5 转化条件对转化效率的影响
• 2.6 转化频率
• 3 讨论
• 3.1 除草剂（BASTA）对不定芽的影响
• 3.2 抗生素对子叶的影响
• 3.3 农杆菌浓度对转化效率的影响
• 3.4 预培养及共培养对转化效率的影响
• 4 小结
• 第三章 以愈伤组织为外植体进行HC-PRO基因的转化
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 根癌农杆菌菌株及载体
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 愈伤组织的诱导
• 1.2.1.1 无菌苗的获得
• 1.2.1.2 愈伤组织的诱导
• 1.2.1.3 愈伤组织的分化
• 1.2.2 基因转化途径
• 1.2.2.1 外植体的准备
• 1.2.2.2 工程菌液的准备及侵染
• 1.2.2.3 农杆菌与外植体共培养
• 1.2.2.4 筛选、分化及生根
• 1.2.3 转化植株的遗传多样性分析（RAPD分析）
• 2 结果及分析
• 2.1 子叶诱导愈伤组织生长曲线的获得
• 2.2 除草剂对愈伤组织的影响
• 2.3 抗生素对愈伤组织分化的影响
• 2.4 工程菌液的准备及转化
• 2.5 转化条件对转化效率的影响
• 2.6 转化效率
• 2.7 转化植株的遗传多样性
• 3 讨论
• 第四章 转化植株的鉴定及其病毒抗性研究
• 1 转化植株的分子生物学鉴定
• 1.1 材料与方法
• 1.1.1 试验材料
• 1.1.2 方法
• 1.1.2.1 PCR检测
• 1.1.2.1.1 DNA的快速微量提取
• 1.1.2.1.2 PCR检测方法
• 1.1.2.1.2.1 反应体系
• 1.1.2.2 Southern杂交检测
• 1.1.2.2.1 DNA提取方法
• 1.1.2.2.2 杂交方法
• 1.1.2.2.2.1 限制性内切酶酶切茎瘤芥总DNA
• 1.1.2.2.2.2 Southern转印
• 1.1.2.2.2.3 探针的制备
• 1.1.2.2.2.4 预杂交、杂交
• 1.1.2.2.2.5 洗膜及放射性自显影
• 1.2 结果与分析
• 1.2.1 PCR检测
• 1.2.2 Southern杂交检测
• 2 转化植株的田间接种鉴定及ELASA分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.1.2.1 病毒接种
• 2.1.2.2 ELASA检测
• 2.2 结果及分析
• 3 讨论
• 参考文献
• 附图 1：基因转化流程
• 附图 2：子叶再生及转化途径
• 附图 3：愈伤组织再生途径