PCAMOXO表达载体的构建及导入甘蓝型油菜（Brassica napus L.）的研究

论文摘要

甘蓝型油菜是世界重要的经济作物之一,但是由于长期受到菌核病等多种病害的危害,其产量和品质受到严重影响。在中国,油菜菌核病居油菜三大病害之首,严重影响了我国的油菜生产。目前,由于其近缘种中还没有发现完全抗或免疫的种质资源,油菜对菌核病的抗性表现为数量性状,易受环境的影响,加之缺乏准确可靠的病害鉴定方法等原因使得常规育种难以选择到真正抗病植株。近年来,随着基因工程技术的发展,利用植物基因工程,转入外源抗真菌基因使油菜获得对菌核病的抗性无疑成为油菜抗病育种的一条可行的新途径。根据致病的关键因子去寻求控制策略是最根本的途径。由于菌核病产生高度致病因子——草酸,因此引入编码草酸降解酶的基因来获得对分泌草酸病原真菌的抗性是一个极具前途的方法。为研究草酸氧化酶基因（Oxalate oxidase gene,OxO）对植物抗病的作用及获得抗菌核病油菜植株,本研究成功构建了含小麦草酸氧化酶基因的植物表达载体pCAMOXO,并以甘蓝型油菜（Brassica napus L.）为试材,进行了农杆菌遗传转化,主要工作及结果如下:1.植物表达载体的构建以pCAMBIA1301为原始载体构建了含抗病基因OXO的植物表达载体pCAMOXO,其中OXO基因来自pUC-35S-gf2.82.适宜农杆菌转化体系的建立以甘蓝型油菜双低杂交品种川油21为材料,油菜下胚轴作为转化受体,建立了适宜的农杆菌转化体系。油菜转化再生系统中最适培养基为:Ⅰ.预培养基:MS+1mg/L2,4-D+0.2mg/L6-BA,pH5.8Ⅱ.分化培养基F1:MS+2.5mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+400mg/LCb+6mgmAgNO3,pH5.8Ⅲ.筛选培养基S1/S2:分化培养基F1中加入10、15mg/LHyg,pH5.8Ⅳ.生根培养基:1/2MS+0.1mg/LIBA+15mg/LHyg+400mg/LCef,pH5.83.潮霉素抗性苗的获得用对数分裂中期OD600为0.3～0.4左右的农杆菌菌液稀释3～5倍侵染3～5min,通过与农杆菌共培养,经潮霉素筛选,得到油菜潮霉素抗性苗8株。4.抗性苗的分子生物学检测利用特异引物对抗性苗进行PCR检测,8株油菜潮霉素抗性苗中3株表现阳性,扩增出与阳性对照一致的470bp的片段。初步证明来自小麦的草酸氧化酶基因已整合到了油菜的基因组中。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 引言
• 1.2 研究现状
• 1.2.1 油菜菌核病的症状及其侵染循环
• 1.2.2 菌核病病原核盘菌的致病机理
• 1.2.3 寄主的抗病机理
• 1.2.4 抗源筛选现状和抗性鉴定方法研究
• 1.2.5 抗病育种途径
• 1.2.6 常用油菜遗传转化的基因元件
• 1.3 本研究的目的意义
• 第二章 材料、方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 质粒及菌种
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 生化试剂
• 2.1.5 主要溶液的配制
• 2.1.6 仪器设备
• 2.1.7 培养条件
• 2.2 方法
• 2.2.1 植物表达载体构建
• 2.2.2 潮霉素抗性植株的获得
• 2.2.3 转基因植株的分子检测
• 2.2.4 转基因植株的抗性鉴定
• 第三章 结果与分析
• 3.1 表达载体构建
• 3.1.1 pCAMOXO表达载体构建
• 3.1.2 质粒酶切鉴定
• 3.1.3 质粒PCR鉴定
• 3.2 潮霉素抗性植株的获得
• 3.2.1 油菜下胚轴高效遗传转化系统的优化
• 3.2.2 油菜转化再生系统中最适培养基的确定
• 3.2.3 转化子的筛选与植株再生
• 3.3 转基因植株的分子鉴定
• 3.3.1 油菜总DNA提取结果
• 3.3.2 再生植株的PCR检侧结果
• 第四章 讨论
• 4.1 不同的植物基因型对转化的影响
• 4.2 外植体对转化的影响
• 4.3 乙酰丁香酮在试验中的应用
• 4.4 试管苗的玻璃化现象
• 4.5 培养物的褐化
• 4.6 分子生物学方面的鉴定
• 4.7 转基因农业的困惑
• 4.7.1 转基因植物对环境安全的影响
• 4.7.2 转基因植物对生态的影响
• 4.7.3 转基因植物对食品安全的影响
• 4.8 后续研究设想
• 第五章 结论
• 1. 植物表达载体的构建
• 2. 适宜农杆菌转化体系的建立
• 3. 潮霉素抗性苗的获得
• 4. 抗性苗的分子生物学检测
• 参考文献
• 致谢
• 附:攻读硕士期间发表与撰写的学术论文