论文摘要
卵巢癌是妇科恶性肿瘤中死亡率居第一的恶性疾患,就诊时绝大多数患者已处于晚期。近30年来,虽经世界各国妇科肿瘤学家的不懈努力,成功探索出在肿瘤细胞减灭术的基础上辅助化疗的治疗策略,但晚期卵巢癌的5年生存率仍徘徊在20%左右。因此,研究卵巢恶性肿瘤的发生发展机制,寻求最根本有效的治疗方案,提高卵巢癌症患者生存质量一直是妇科肿瘤学者面临的重大挑战。人类白细胞抗原- G(human leukocyte antigen G,HLA-G)和人类白细胞抗原-E(human leukocyte antigen E,HLA-E)是近年来发现的非经典HLA-I类分子,HLA-G能与NK细胞、T细胞亚类、抗原递呈细胞、B细胞和单核细胞系的抑制性受体结合,从而抑制机体的免疫功能;HLA-G还可促进肿瘤细胞表达HLA-E,而后者也可通过与NK细胞和T细胞表面的抑制性受体相互作用而抑制两者的细胞溶解作用。HLA-G和HLA-E最早在胎盘绒毛膜外滋养层细胞表面发现有大量表达,二者在胎儿免疫耐受方面的作用机制已得到国内外学者的公认,并且对于两种抗原与肿瘤的关系也进行了初探。1998年,HLA-G抗原mRNA表达首先在皮肤黑色素瘤细胞系被报道,随后其在肾肿瘤、乳腺肿瘤、结直肠癌、肺癌、淋巴瘤、膀胱癌、胶质母细胞瘤中相继报道,大多数研究认为恶性肿瘤表达HLA-G抗原,且其抗原表达与肿瘤的免疫逃逸有关。但迄今为止二者在卵巢恶性肿瘤中的表达情况报道甚少且尚无定论。2006年国外研究报道了孕激素、绒毛膜促性腺激素可通过上调HLA-G的水平以达到保胎的目的,由此推测临床的引产药物如天花粉蛋白、米非司酮等引起流产的机理可能与其能下调HLA-G、HLA-E的水平有关,进而推测这些药物在免疫逃逸方面的抗肿瘤机制,为恶性肿瘤临床免疫治疗、生物治疗开辟出新的途径,该方面的研究目前国内外未见报道。本研究试图通过检测卵巢恶性肿瘤实体组织和体外培养细胞中HLA-G、HLA-E的mRNA和蛋白水平,分析其在卵巢肿瘤免疫逃逸中的作用。观察顺铂、天花粉蛋白和米非司酮对卵巢癌细胞生长的抑制作用及药物作用前后细胞中HLA-G、HLA-E mRNA和蛋白水平的变化,明确药物的抗肿瘤作用及其机制。并用卵巢癌细胞株进行裸鼠动物模型试验,观察药物对肿瘤生长及对肿瘤组织中HLA-G、HLA-E表达情况的影响,在此基础上寻找出有效的抗癌药物,为卵巢恶性肿瘤发生机制及生物治疗研究提供新的思路和理论依据。第一部分卵巢恶性肿瘤HLA-G、HLA-E mRNA及蛋白表达水平与其临床生物学行为的关系目的:检测HLA-G、HLA-E在良、恶性卵巢肿瘤和正常卵巢组织中的表达及与卵巢恶性肿瘤生物学行为的关系。方法:采用半定量逆转录-聚合酶链反应(Reversed Transcript-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)和流式细胞分析技术检测60例卵巢恶性肿瘤、30例良性肿瘤和10例正常卵巢组织中HLA-G、HLA-E的mRNA和蛋白水平,并结合肿瘤组织类型、临床分期、病理分级等临床病理特征进行综合分析。结果:①恶性组、良性组及正常组卵巢组织HLA-G mRNA阳性表达率分别为93.33%、73.33%、60%,蛋白阳性表达率分别为61.67%、16.67%、10%。经χ2检验,恶性组HLA-G mRNA和蛋白阳性表达率均显著高于良性组与正常组;而良性组同正常组相比,统计学差异不显著。②恶性组、良性组及正常组卵巢组织HLA-E mRNA阳性率分别为96.67%、83.33%、70%,蛋白阳性表达率分别为75%、36.67%、30%。经χ2检验,恶性组HLA- E mRNA阳性表达率显著高于正常组,也有高于良性组的趋势(χ2=3.272,P=0.07);恶性组HLA-E蛋白阳性表达率显著高于良性组及正常组。而良性组同正常组相比,HLA-E表达无统计学差异。③不同组织类型之间HLA-G mRNA和蛋白表达均无统计学差异。不同临床分期之间HLA-G mRNA表达无统计学差异,但Ⅰ/Ⅱ期有低于Ⅲ/Ⅳ期的趋势(χ2=4.133,P=0.077);HLA-G蛋白阳性表达率随临床分期进展而增高。不同分化程度之间HLA-G mRNA表达有统计学差异,高分化组HLA-G mRNA和蛋白表达显著低于低分化组。④不同组织类型之间HLA-E mRNA和蛋白表达均无统计学差异。不同临床分期之间HLA- E mRNA表达没有统计学差异,但Ⅰ/Ⅱ期有低于Ⅲ/Ⅳ期的趋势(χ2=4.828,P=0.086);HLA- E蛋白表达率随临床分期进展而增高。不同分化程度之间HLA-E mRNA和蛋白阳性表达率有统计学差异,高分化组显著低于低分化组。结论:①卵巢恶性肿瘤组HLA-G、HLA-E表达均显著高于良性肿瘤组和正常组;②HLA-G、HLA-E表达与卵巢恶性肿瘤组织类型无关;与临床分期和病理分级显著相关,临床分期越晚、组织分化程度越差,抗原表达水平越高。③HLA-G、HLA-E可能参与了卵巢恶性肿瘤的发生、发展过程,从而使癌细胞产生免疫耐受,逃逸宿主的免疫监视。第二部分卵巢癌细胞中HLA-G、HLA-E mRNA及蛋白表达水平检测目的:检测HLA-G、HLA-E在卵巢癌细胞中mRNA和蛋白水平的表达情况,为进一步开展卵巢癌的临床免疫治疗提供细胞基础实验依据。方法:培养卵巢癌细胞株SKOV3、3AO、OVCAR3,采用RT-PCR和流式细胞分析技术检测细胞中mRNA和蛋白水平的表达情况,并以高表达HLA-G的绒癌JEG-3细胞做为阳性对照。结果:卵巢癌SKOV3细胞HLA-G、HLA-E mRNA和蛋白表达均为阴性;卵巢癌3AO细胞HLA-G mRNA和蛋白表达为阴性,HLA-E mRNA和蛋白表达为阳性;卵巢癌OVCAR3细胞HLA-G mRNA表达为阳性、蛋白表达为阴性,HLA-E mRNA和蛋白表达均为阳性;绒癌JEG-3细胞HLA-G、HLA-E mRNA和蛋白表达均为强阳性。结论:虽然不同卵巢癌细胞株表达HLA-G、HLA-E水平有所不同,但还是从细胞水平验证了HLA-G、HLA-E在卵巢癌免疫逃逸方面的作用。并为下部分药物干预研究提供了同时表达HLA-G和HLA-E的卵巢癌OVCAR3细胞系。第三部分天花粉蛋白、米非司酮、顺铂对卵巢癌细胞生长的影响目的:检测天花粉蛋白、米非司酮及顺铂对卵巢癌细胞系生长的影响,明确药物的抗肿瘤作用。方法:培养卵巢癌细胞株SKOV3、3AO、OVCAR3,MTT技术观察不同浓度天花粉蛋白、米非司酮、顺铂对三种细胞株生长增殖能力的影响。结果:①10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml天花粉蛋白对SKOV3细胞的生长抑制率分别为0、3.67%、18.60%、34.46%、46.96%;对3AO细胞分别为0、2.97%、9.17%、35.01%、48.98%;对OVCAR3细胞分别为1.06%、9.03%、14.95%、39.66%、58.65%。药物浓度越高,对细胞生长抑制率越强。②2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml米非司酮对SKOV3细胞的生长抑制率分别为2.45%、4.52%、5.98%、21.67%、30.03%;对3AO细胞分别为11.38%、17.93%、20.82%、45.75%、58.63%;对OVCAR3细胞分别为8%、24.88%、47.6%、61.58%、76.94%。③1.5625μg/ ml、3.125μg/ ml、6.25μg/ ml、12.5μg/ ml、25μg/ ml顺铂对SKOV3细胞的生长抑制率分别为5.68%、17.27%、21.75%、45.32%、54.98%;对3AO细胞分别为25.55%、39.81%、63.07%、86.93%、95.28%;对OVCAR3细胞分别为17.82%、29.25%、60.15%、70.57%、85.67%。顺铂对细胞生长抑制作用呈浓度依赖性。结论:天花粉蛋白、米非司酮和顺铂对卵巢癌细胞SKOV3、3AO、OVCAR3生长具有明显抑制作用,并呈浓度依赖性。从体外实验明确了天花粉蛋白、米非司酮、顺铂具有抗卵巢癌作用,为进一步药物机制的研究及动物体内实验的开展提供了理论依据。第四部分天花粉蛋白、米非司酮、顺铂对卵巢癌细胞中HLA-G、HLA-E mRNA及蛋白表达水平的影响目的:探讨天花粉蛋白、米非司酮、顺铂是否能够通过下调HLA-G、HLA-E的表达,达到抑制肿瘤生长的目的。方法:继续培养表达HLA-G、HLA-E的卵巢癌OVCAR3细胞株和高表达HLA-G的绒毛膜癌JEG-3细胞株,采用RT-PCR和流式细胞分析技术检测天花粉蛋白、米非司酮、顺铂对细胞中HLA-G、HLA-E mRNA和蛋白表达水平的影响。参照第三部分结果,选取药物浓度:天花粉蛋白注射液浓度为500μg/ml、1000μg/ml,米非司酮终浓度为20μg/ml、40μg/ml,顺铂浓度为6.25μg/ml、12.5μg/ml。结果:①天花粉蛋白能明显下调OVCAR3细胞中HLA-G mRNA水平,对照组、500μg/ml组、1000μg/ml组光密度值分别为1.00±0.12、0.64±0.24、0.36±0.08,其中1000μg/ml组中HLA-G mRNA光密度值显著低于500μg/ml组(P﹤0.01);天花粉蛋白能明显下调OVCAR3细胞中HLA-E mRNA和蛋白表达水平,对照组、500μg/ml组、1000μg/ml组光密度值分别为1.14±0.09、0.82±0.05、0.65±0.06,荧光指数分别为2.29±0.12、1.77±0.09、1.37±0.11,而且,1000μg/ml组中HLA- E mRNA和蛋白表达水平显著低于500μg/ml组(均为P﹤0.01)。②米非司酮能明显下调OVCAR3细胞中HLA-G mRNA水平,对照组、20μg/ml组、40μg/ml组OVCAR3细胞中光密度值分别为1.02±0.14、0.67±0.14、0.35±0.12;20μg/ml组和40μg/ml组天花粉蛋白能明显下调OVCAR3细胞HLA-E mRNA和蛋白表达水平,均为P﹤0.01。③顺铂对OVCAR3细胞中HLA-G mRNA表达无明显影响,对照组、6.25μg/ml组、12.5μg/ml组HLA-G mRNA光密度值分别为1.02±0.09、0.98±0.11、0.94±0.07,组间方差分析F=1.138,P>0.05;对照组、6.25μg/ml组、12.5μg/ml组OVCAR3细胞中HLA- E mRNA光密度值分别为0.96±0.16、0.94±0.08、0.81±0.11,组间方差分析F=2.601,P>0.05。12.5μg/ml浓度顺铂作用于OVCAR3后,细胞中HLA-E mRNA表达有下降趋势,但无统计学意义(P=0.052)。6.25μg/ml和12.5μg/ml顺铂均能明显下调OVCAR3细胞HLA-E蛋白表达水平,分别为P<0.05、P<0.01。④同样浓度的天花粉蛋白、米非司酮都能明显下调绒癌JEG-3细胞中HLA-G、HLA-E mRNA和蛋白表达水平,均为P<0.01。但顺铂对JEG-3细胞中HLA-G、HLA-E表达的影响无统计学差异。结论:三种药物可不同程度的拮抗卵巢癌免疫逃逸,天花粉蛋白和米非司酮治疗卵巢癌的作用机制同顺铂有所不同,与顺铂联合应用,可能会取得更好的治疗效果,为进一步动物移植瘤模型观察药物疗效提供了可行性依据。第五部分天花粉蛋白、米非司酮、顺铂对荷人卵巢癌裸鼠肿瘤生长及移植瘤组织HLA-G、HLA-E mRNA及蛋白表达水平的影响目的:模拟肿瘤生成的体内环境,进一步获得在体内药物干预后HLA-G、HLA-E水平变化的详实材料,深入探讨天花粉蛋白、米非司酮、顺铂在卵巢恶性肿瘤治疗中的作用机制,为临床药物的合理应用提供更充分有力的动物实验依据。方法:①培养卵巢癌OVCAR3细胞株。②饲养BALB/c裸鼠,将细胞悬液注入裸鼠右侧肩胛背部,每只0.2ml,含细胞数1.2×106,约7天后明显成瘤,接种成功率为100%。③待裸鼠生长至接种后第2周,肿瘤界限清楚后,将裸鼠随机分为5组,每组7只,包括:对照组、天花粉蛋白组、米非司酮组、顺铂组、顺铂和米非司酮联合用药组。④用药4周后,处死裸鼠,观察各组皮下移植瘤体积,采用RT-PCR方法和流式细胞技术检测不同分组瘤组织中HLA-G、HLA-E mRNA和蛋白表达情况。结果:①对照组、天花粉蛋白组、米非司酮组、顺铂组及联合组移植瘤体积分别为( 6100.83±1000.69 ) mm3、( 3500.46±562.04 ) mm3、(3689.30±1017.66)mm3、(3491.40±820.13)mm3、(2532.55±762.56)mm3。各用药组抑瘤率均明显小于对照组,米非司酮组和顺铂组对肿瘤的抑制率都明显低于联合组。②对照组、天花粉蛋白组、米非司酮组、顺铂组及联合组HLA-G mRNA表达光密度值分别为1.01±0.17、0.71±0.18、0.62±0.10、0.89±0.11、0.49±0.10,蛋白表达荧光指数分别为2.38±0.43、1.45±0.35、1.26±0.31、2.29±0.35、1.08±0.25。HLA-G mRNA和蛋白表达在顺铂组无明显改变,在其余各组都显著降低。米非司酮和联合组HLA-G mRNA和蛋白表达显著低于顺铂组,前两组相比,差别无统计学差异。HLA-G mRNA和蛋白表达之间有相关性(r=0.692,P﹤0.01)。③对照组、天花粉蛋白组、米非司酮组、顺铂组及联合组HLA-E mRNA表达光密度值分别为0.99±0.19、0.67±0.18、0.76±0.17、0.96±0.16、0.69±0.21,蛋白表达荧光指数分别为2.27±0.19、2.02±0.17、1.59±0.15、2.17±0.19、1.36±0.25。HLA-E mRNA和蛋白表达在顺铂组无明显改变,在其余各组都显著降低,米非司酮和联合组HLA-E mRNA和蛋白表达显著低于顺铂组。HLA-E mRNA和蛋白表达之间有相关性(r=0.472, P﹤0.01)。④HLA-G与HLA- E mRNA表达相关性比较,r=0.388, P﹤0.05;蛋白表达相关性比较,r=0.668, P﹤0.01。结论:①天花粉蛋白、米非司酮和顺铂都能明显抑制裸鼠皮下抑制瘤生长,米非司酮和顺铂联合应用对肿瘤的抑制作用明显强于单一用药组,表明米非司酮和顺铂对卵巢癌的治疗有协同作用。②与顺铂不同,天花粉蛋白和米非司酮的抗肿瘤作用机制之一是能够明显下调肿瘤组织中HLA-G和HLA-E的表达水平,打破机体对肿瘤的免疫抑制,恢复效应细胞的杀瘤功能,同顺铂联合使用,有望取得更好的治疗效果。③HLA-G mRNA和蛋白表达之间、HLA-E mRNA和蛋白表达之间及HLA-G和HLA-E两种抗原表达之间统计学分析存在相关性,提示临床可以采用比较简单实用的检测手段测定抗原水平,将其作为判断肿瘤恶性程度、监测病情进展的标志物。