缺营养诱发胆管癌细胞自噬对化疗药物敏感性影响及机制研究

论文摘要

胆管癌（Cholangiocarcinoma）是全球常见的恶性肿瘤之一,且发病率呈逐年上升趋势。胆管癌的治疗目前仍是以手术为主的综合治疗,手术为其首选治疗方法,但由于肿瘤分化程度低,恶性度高,使得手术后复发率高,预后差。而晚期肿瘤患者,已丧失手术机会,治疗以放化疗为主,但胆管癌对放化疗不敏感,治疗效果差,预后不佳。因此,研究胆管癌对化疗的不敏感性对提高胆管癌的疗效以及提高病人生存率有很重要的意义。虽然目前对胆管癌的耐药机制研究较多,但确切的机制仍不清楚。新近研究表明,细胞自噬可能与肿瘤的耐药有关。细胞对自噬的形成有着精细的调节,这过程有多种基因的参与,这些基因称为自噬相关基因atg（autophagy related gene）,它们编码的蛋白参与自噬的诱导、产生、成熟和再循环,同时自噬还受到一些信号途径如PI-3K/AKT/mTOR及p38-MAPK等的调控。自噬的过程受一系列复杂的信号调控,自噬异常与肿瘤发生、神经退行性疾病、衰老等有重要的联系。p53是一种著名的肿瘤抑制基因以及功能蛋白,对抑制肿瘤的发生发展起着非常重要的作用。但在所有恶性肿瘤中,仅有50%左右会出现该基因的突变,其他的发病机制尚不明确。有研究表明,在p53表达而引起细胞凋亡的情况下,只有在未发生细胞凋亡的肿瘤细胞中发现细胞自噬。所以,在缺血缺营养环境中,胆管癌细胞的凋亡逃逸乃至对化疗药物的抵抗,极有可能由自噬介导并有p53基因的参与。为证实这一猜想,本课题从以下两方面进行研究：第一部分研究缺血缺营养对胆管癌细胞化疗敏感性的影响；第二部分研究在缺血缺营养环境中p53参与的自噬在胆管癌细胞对化疗药物不敏感中的作用机制。本研究首先将胆管癌细胞系（QBC）培养在全营养和自噬诱导培养基EBSS（无氨基酸无血清）中,分别用化疗药物（5FU、顺铂）处理12h,利用cck8法检测细胞活性,用DAPI染色来检测细胞死亡,以全营养和缺营养情况下未用药的对照组为基准,比较不同营养情况下胆管癌细胞在化疗药作用下的死亡率。结果发现缺营养情况下胆管癌细胞对化疗药物的敏感性降低。由于缺血缺营养是细胞发生自噬的天然诱导剂,新近的研究表明自噬与肿瘤对化疗不敏感有关,这些研究提示我们,自噬可能参与了胆管癌细胞对化疗的抗性,因此我们进一步研究胆管细胞癌缺营养是否诱导了自噬的发生。随后,将胆管癌细胞系（QBC）培养在全营养和自噬诱导培养基EBSS（无氨基酸无血清）中,应用电子透射显微镜检测自噬小体,比较不同营养情况下自噬的表达情况。同时我们也利用转染LC3-GFP质粒检测和比较不同营养情况下胆管癌细胞成点状绿色荧光的数量；结果表明,胆管癌细胞在缺营养情况下自噬小体的形成数量要高于全营养情况,同时成点状绿色荧光的数量也明显增多。这些结果表明胆管细胞癌在缺营养情况下诱导了自噬的发生。对胆管癌自噬的进一步的研究还证实抑制自噬增加肿瘤细胞在缺营养情况下的死亡率和对化疗的敏感性。将胆管癌细胞系（QBC）培养在全营养和自噬诱导培养基EBSS（无氨基酸无血清）中,预先应用自噬抑制剂（3MA）作用2h,分别用化疗药物（5FU、顺铂）处理12h,利用cck8法检测细胞活性,在倒置相差显微镜下观察细胞形态的变化,用DAPI染色来检测细胞凋亡,比较和观察在全营养、缺营养及缺营养加自噬抑制剂情况下,肿瘤细胞的死亡情况以及在化疗药物作用下的死亡情况。结果发现在抑制自噬和缺营养的情况下,肿瘤细胞死亡增加,同时肿瘤细胞对化疗药物的敏感性也增加。综合上面的实验结果,我们的研究表明自噬不但是胆管癌细胞在缺营养情况下的生存机制之一,同时也有助于胆管癌细胞抵抗的化疗的作用。但是目前关于自噬抵抗化疗的具体机制还不是很清楚。自噬是体内唯一的一个降解细胞器的途径,同时已有研究也显示p53在肿瘤细胞的自噬发生过程起到很重要的作用。因此在胆管癌细胞中我们关注p53在自噬诱导胆管癌细胞对化疗药物不敏感中的作用。在进一步的实验中,我们将胆管癌细胞系（QBC）培养在全营养和自噬诱导培养基EBSS（无氨基酸无血清）中,预先应用p53抑制剂PFT-a作用1h,然后继续培养在全营养和自噬诱导培养基EBSS（无氨基酸无血清）中12h。应用电子透射显微镜检测自噬小体的形成。同时我们也利用转染LC3-GFP质粒检测和比较p53抑制和未抑制情况下胆管癌细胞成点状绿色荧光的数量；结果表明,胆管癌细胞在缺营养联合p53抑制情况下自噬小体的形成数量低于p53未抑制情况,同时成点状绿色荧光的数量也明显减少。进一步的研究还显示在p53抑制联合缺营养的情况下,分别用化疗药物（5FU、顺铂）处理24h,利用cck8法检测细胞活性,在相差显微镜倒置相差显微镜下观察细胞形态的变化,用DAPI染色米检测细胞凋亡,比较和观察在全营养、缺营养及缺营养加自噬抑制剂情况下,肿瘤细胞的死亡情况以及在化疗药物作用下的死亡情况。结果发现在缺营养的情况下抑制p53增加肿瘤细胞死亡,同时肿瘤细胞对化疗药物的敏感性也增加。这个结果表明p53的激活可能参与了胆管癌对化疗的不敏感。综上所述,本课题得出以下结论：1、营养缺乏能诱导胆管癌细胞激活自噬,自噬能诱导胆管癌细胞对化疗不敏感,抑制自噬能提高肿瘤细胞在缺营养情况下的死亡率以及对化疗的敏感性。2、p53参与了营养缺乏情况下胆管癌细胞自噬的激活,在营养缺乏情况下抑制p53能提高肿瘤细胞的死亡率以及对化疗的敏感性。总之,我们的研究表明,自噬的激活参与了胆管癌细胞对化疗的不敏感,p53可能参与了营养缺乏情况下胆管癌细胞自噬的激活,这可能是胆管癌抵抗化疗的机制之一。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 前言
• 参考文献
• 正文
• 一、材料和方法
• 二、结果
• 讨论
• 参考文献
• 小结
• 附录一
• 附录二
• 综述一
• 综述二
• 在读期间发表论文
• 致谢