论文摘要
研究背景神经-内分泌-免疫网络是机体重要的调节系统,三者之间相互协调、相互平衡,从而维持机体功能的稳态。当这种平衡被各种理化因素破坏时,会导致病理过程的出现和/或某些疾病的发生。交感神经系统是神经-内分泌-免疫网络的重要组成部分,在维持机体功能稳态的过程中发挥着非常重要的作用。在生理情况下,交感神经激活后,其末梢释放的儿茶酚胺类物质,通过与分布在靶器官上的肾上腺素受体结合,来调节各种靶器官的功能活动。有大量研究发现儿茶酚胺类物质的异常释放与很多疾病的发生发展密切相关。然而,在某些病理情况下,机体表现出交感神经系统过度激活的现象并不能完全用儿茶酚胺类物质大量释放来解释,提示可能还有其他未知因素的参与。上世纪九十年代以来,诸多研究人员在扩张型心肌病、原发性电紊乱以及chagas病等多种心血管疾病患者血清中发现有类儿茶酚胺的物质,进一步的研究发现,这种物质是针对β1-AR细胞外第二环（the second extracellular loop ofβ1-adrenoceptor,β1-AR-ECII）的自身抗体,即β1-AA（Autoantibodies against the second extracellular loop ofβ1-adrenoceptor）,它可以与β1-AR-ECII结合发挥类激动剂样的作用,提示β1-AA可能与交感神经系统过度激活有关。以往人们对β1-AA的研究只局限于其对心血管系统的影响,随着神经-内分泌-免疫网络学的发展,这种自身抗体对机体的影响有待重新审视。已有研究发现,β-AR的激动剂异丙肾上腺素（ISO）可以调节免疫系统的功能。我们的前期研究用主动免疫的方法诱导大鼠产生β1-AA,即用人β1-AR-ECII （人鼠同源性为100%）主动免疫Wistar大鼠18个月后,结果发现:在大鼠心脏结构和功能发生明显障碍的同时,反映大鼠T淋巴细胞活性状态的外周血CD4+/CD8+淋巴细胞比值也升高,提示β1-AA的长期存在可能会导致机体的免疫功能发生改变。但是,主动免疫过程是将抗原肽段注入大鼠体内,在此过程中抗原肽段本身可能会导致机体免疫系统功能发生改变,因此该研究还不能得出β1-AA长期存在可以直接导致免疫系统发生改变的结论;另外,由于在此过程中,动物体内产生的β1-AA远高于临床患者血清中该抗体的水平,因而用主动免疫模型的研究结果来解释临床也并不合理。因此,我们需要建立血清中β1-AA浓度接近临床实际情况的动物模型,进一步观察β1-AA长期存在对机体免疫系统功能的影响。众所周知T淋巴细胞是机体免疫系统中功能最重要的一类细胞群,而T淋巴细胞的增殖是其发挥多种生物学功能的前提。已有研究报道,儿茶酚胺类物质可以通过β1-AR-cAMP-PKA、β2-AR-cAMP-PKA、β1/β2-AR-PKC以及Ca2+途径来调节靶细胞的功能活动。而在大鼠的T淋巴细胞表面存在的β-AR亚型主要是β2-AR,其表面几乎不存在β1-AR,那么,该自身抗体对大鼠T淋巴细胞的增殖是否有影响?如果有,是通过何种途径来实现的?Ca2+又在其中扮演何种角色?决定T淋巴细胞功能特征的关键因素是它们所分泌的细胞因子种类。其中IL-2和IFN-γ是由Th1细胞合成和分泌的,反映机体细胞免疫功能;而IL-4是由Th2合成和分泌,介导体液免疫。因此我们在本研究中检测这些细胞因子的分泌水平来反映机体的免疫功能状态。目前研究报道,在人的T淋巴细胞上可同时表达有β1-AR、β2-AR以及β3-AR。鉴于在大鼠的T淋巴细胞表面几乎不表达β1-AR,所以我们不能完全用以上动物实验结果来反映β1-AA对临床患者免疫系统的影响。因此,我们选用人外周血T淋巴细胞,观察β1-AA对人外周血T淋巴细胞增殖和分泌的影响?并进一步分析其途径。综上所述,本课题的研究目的（1）建立与临床患者血清中β1-AA滴度相匹配的β1-AA被动免疫大鼠模型,观察β1-AA长期存在对机体免疫功能是否有影响?（2）以免疫磁珠分选的大鼠脾脏T淋巴细胞为研究对象,研究β1-AA对大鼠T淋巴细胞增殖和分泌功能的影响?（3）以免疫磁珠分选的人外周血T淋巴细胞为研究对象,研究β1-AA对人T淋巴细胞的增殖和分泌功能的影响,同时探索其作用途径如何?第一部分β1-AA长期存可以导致大鼠免疫系统功能改变研究目的建立与临床患者血清中β1-AA水平相匹配的β1-AA被动免疫大鼠模型,观察β1-AA长期存在对机体免疫功能的影响。材料和方法1.实验动物健康雄性Wistar大鼠,8周龄,体重180-200g。2.实验方法2.1抗原肽段的合成根据人β1肾上腺素受体细胞外第二环的氨基酸序列（β1-AR-ECII）（197aa-223aa,H-W-W-R-A-E-S-D-E-A-R-R-C-Y -N-D-P-K-C-C-D-F-V-T-N-R-A）,由吉尔生化上海有限公司合成抗原肽段,纯度>95%。2.2获取β1-AA选用健康的8周龄雄性Wistar大鼠作为免疫对象,随机分为两组:①β1-AR-ECII肽段组即免疫组（n=40）:将抗原和免疫佐剂的混合物按0.4μg/g剂量注入动物背部皮下,每两周加强免疫一次,共免疫8周。②溶剂对照组即伪免疫组（n=40）:将生理盐水和免疫佐剂的混合物以一定比例注入动物背部皮内,每两周加强免疫一次,共免疫8周。用SA-ELISA （Streptavidin-enzyme linked immunosorbent assay）方法检测血清中β1-AA的水平。利用MAb Trap Kit试剂盒对免疫组阳性血清中的β1-AA及伪免疫组阴性血清中的IgG进行提取和纯化。纯化后的抗体蛋白经SDS-PAGE胶凝胶电泳检测其纯度,使用BCA试剂盒进行蛋白定量。2.3大鼠被动免疫β1-AA组:将提纯后的β1-AA IgGs按2μg/g体重剂量经鼠尾静脉注入大鼠体内,每2周加强免疫一次,共免疫20周;伪免疫组:将从β1-AA阴性的血清中提纯的IgGs注射到大鼠体内,免疫方法和剂量同前一组。2.4大鼠在体心功能检测建立被动免疫模型后,定期（0w、4w、8w、12w、16w、20w）监测大鼠的心功能。每组随机抽取5只大鼠,氨基甲酸乙酯（20%,1g/kg）腹腔麻醉后,经右颈总动脉小心插向左心室,以出现特征性左心室压力波为插入标志后,固定导管,打开动脉夹。用BL-410生物信号记录分析系统检测并记录各心功能参数:左心室收缩压（Left Ventricular Systolic Pressure,LVSP）、左心室舒张末期压（Left Ventricular End-Diastolic Pressure,LVEDP）、左心室压力上升的最大速率(+dp/dtmax)和左心室压力下降的最大速率(-dp/dtmax)。2.5大鼠脾脏淋巴细胞分离大鼠麻醉,无菌取出大鼠脾脏;用注射器内芯研磨脾脏,过200目筛网,获取单细胞悬液;低渗破坏红细胞后,获取脾脏淋巴细胞。2.6流式细胞术检测大鼠外周血CD4+/CD8+ T淋巴细胞比值测定取100μL外周血（1×106个/mL）,按试剂说明书分别加入FITC标记的CD4抗体与PE标记的CD8抗体,同时另设管标记FITC或PE荧光标记的单克隆大鼠IgG1抗体作为阴性对照,避光室温作用20min;用PBS溶液,洗细胞3次;200μL PBS溶液重悬细胞,上流式细胞仪获取10,000个细胞,先以阴性对照测出本底参数,再进行样本测定,计算机读出测定值。以T淋巴细胞CD4+/CD8+值评估机体免疫状态。2.7被动免疫大鼠B淋巴细胞抗体生成能力测定用20%绵羊红细胞（SRBC）生理盐水悬液腹腔免疫大鼠,4天后无菌取出脾脏,用PBS洗一次后置平皿中不锈钢筛网上,用无菌注射器针芯研磨成悬液,PBS洗涤两次,用RPMI1640调整细胞数为5×106/mL。按照Jerne和Nordin等改良的直接及间接溶血空斑实验测定B淋巴细胞抗体生成能力。空斑数量采用VilBer Lourmat capt软件测定。2.8大鼠心脏、肝脏、肾脏组织石蜡切片的HE染色将石蜡切片用二甲苯脱蜡;经各级乙醇梯度脱水后蒸馏水洗;苏木素染色5min,伊红染色2min;常规脱水,透明,封片,光镜下观察心脏、肝脏、肾脏的组织病理切片。结果1通过主动免疫大鼠成功获取β1-AA1.1主动免疫大鼠模型建立成功大鼠在第一次免疫后2周,与伪免疫组相比,β1-AR-ECII肽段免疫组血清中β1-AA的OD值已由0.73±0.06升高到0.41±0.05（P<0.05）;到8周时免疫组血清中的β1-AA的OD值达到3.02±0.09,远高于伪免疫组0.40±0.02（P<0.01）,（图1-1）。本结果提示主动免疫模型建立成功。1.2β1-AA蛋白定性及定量测定结果用亲和柱纯化β1-AA,纯化后的β1-AA经SDS-PAGE凝胶电泳检测纯度,结果有两条带出现（图1-2）,分别是IgG重链（55KD）和轻链（25KD）,此条带与IgG标准品相一致,表明纯化效果理想。纯化后的β1-AA经BCA试剂盒测定:蛋白浓度为8mg/mL。2β1-AA被动免疫大鼠模型建立成功2.1被动免疫过程中大鼠体内β1-AA水平维持在一定水平在被动免疫前,大鼠血清中β1-AA的OD值为0.08±0.030,到被动免疫第4周时,血清中β1-AA的OD值达到0.22±0.029,明显高于伪免疫组的OD值0.09±0.040（P<0.001）。随着被动免疫时间的延长,免疫组大鼠血清中的β1-AA水平可以维持在一定水平,并且与伪免疫组相比,都有明显统计学差异（P<0.001,图1-3）。2.2β1-AA被动免疫大鼠在体心功能的变化在被动免疫后8周,与伪免疫组相比,免疫组大鼠的左室收缩压（LVSP）和室内压上升的最大速率(+dp/dtmax)（反映左室收缩功能的指标）明显升高,而反映左室舒张功能的指标左室舒张末压（LVEDP）和室内压下降的最大速率(-dp/dtmax)没有明显变化（P>0.05）。到被动免疫第20周时,与伪免疫组相比,免疫组大鼠的LVSP明显下降、+dp/dtmax明显下降、LVEDP明显升高、-dp/dtmax明显下降。（图1-4A,B,C,D）提示:随着被动免疫时间的延长,免疫组大鼠心功能出现了明显下降。3β1-AA长期存在导致大鼠机体免疫功能发生改变3.1β1-AA长期存在可以导致大鼠外周血CD4+/CD8+T淋巴细胞比值增加在被动免疫4周时,β1-AA免疫组的CD4+/CD8+T细胞比值开始升高,但与伪免疫组相比无统计学差异（P>0.05）;到免疫第8周时,β1-AA免疫组的CD4+/CD8+比值由伪免疫组的2.00±0.45升高到免疫组2.92±0.39（P<0.05）,并且在被动免疫8周以后,这种增高趋势仍然持续,到被动免疫20周时,免疫组CD4+/CD8+比值升高到3.49±0.42,远高于伪免疫组1.89±0.40（P<0.01）（图1-5）。结果提示,β1-AA在体内长期存在,可以导致机体的细胞免疫功能发生改变。3.2β1-AA长期存在可以使大鼠B淋巴细胞抗体生成能力增强本研究采用直接及间接溶血空斑实验来测定β1-AA长期存在大鼠B淋巴细胞的功能（即抗体生成能力）来反映机体的体液免疫功能。结果显示,在免疫第8周时,β1-AA被动免疫组大鼠直接溶血空斑数量和间接溶血空斑数量分别达到960±89,1527±84,与伪免疫组相比（810±67,1321±78）,均有明显增多（P<0.05）,并且在8周后溶血空斑数量呈持续增高趋势,到20周时这种差异更为明显（P<0.01）（图1-6A, B）。以上结果提示,在β1-AA长期存在于体内,大鼠出现免疫系统抗体生成能力增强,即体液免疫功能增强。3.3β1-AA长期存在可以导致大鼠心脏、肝脏、肾脏淋巴细胞浸润被动免疫20周时,大鼠心脏进行HE染色发现:在β1-AA免疫组心肌细胞排列紊乱,并且在间质有淋巴细胞浸润;而伪免疫组心肌组织形态与间质均未见异常（图1-7）;在免疫20周时,大鼠肝脏HE染色显示:在肝窦周围有大量淋巴细胞浸润（图1-8）,对照组未发生明显改变;同时,免疫组大鼠肾脏的肾小球和肾小管周围也有大量淋巴细胞浸润（图1-9）,而伪免疫组未见明显改变。小结一1.用纯化的β1-AA长期被动免疫可建立与临床病人抗体水平匹配的动物模型。2.β1-AA长期存在可引发机体的细胞免疫功能改变。3.β1-AA长期存在可以使B淋巴细胞抗体生成能力增强。第二部分β1-AA主要通过β2-AR途径促进ConA激活的大鼠T淋巴细胞增殖和分泌功能研究目的1.以免疫磁珠分选的大鼠脾脏T淋巴细胞为研究对象,研究β1-AA对大鼠T淋巴细胞增殖和分泌功能的影响。2.观察钙离子在β1-AA促进大鼠T淋巴细胞增殖中的作用。材料与方法1.实验对象健康雄性Wistar大鼠。2.实验方法2.1大鼠脾脏CD3+T淋巴细胞分离无菌取出大鼠脾脏;用注射器内芯研磨脾脏,过200目筛网,获取单细胞悬液;低渗溶液破坏红细胞后,获取脾脏淋巴细胞;用免疫磁珠分选CD3+的T淋巴细胞。采用流式细胞技术检测分选的大鼠CD3+T淋巴细胞的阳性率;采用Guava PCA CytoSoft6.0.2软件的ViaCount模块进行细胞活性测定。2.2利用免疫荧光化学方法观察β1-AR在大鼠T淋巴细胞上的表达将纯化分离的大鼠T淋巴细胞进行涂片,用4%的多聚甲醛室温固定20min后,PBS漂洗三次,用含10%胎牛血清的PBS室温封闭2h;加入特异性一抗4℃孵育过夜;PBS漂洗3次,加入二抗37℃避光孵育半小时;去除二抗,加入DAPI染色液室温作用15min以上,PBS冲洗三次,封片,激光共聚焦显微镜下观察。2.3实验分组2.3.1观察β1-AA对分选的淋巴细胞的增殖的影响,分为以下2组:（1）溶剂对照组:分选的淋巴细胞加入生理盐水;（2）β1-AA处理组:分选的淋巴细胞直接加入β1-AA。2.3.2根据T淋巴细胞的活化特性,分为以下2组（1）溶剂组对照:分选的T淋巴细胞加入生理盐水;（2）ConA处理组:给予分选的T淋巴细胞5μg/mL ConA预刺激72h。将激活的T淋巴细胞悬液均匀接种于96孔细胞培养板（100μL/孔）,每孔分别加入20μL各种干预因素:2.3.3为了观察β1-AA对ConA激活的T淋巴细胞是否有促增殖作用分为以下5组（1）溶剂对照组:生理盐水;（2）阴性对照:β1-AA阴性血清IgGs组（0.1μmol/L）;（3）阳性对照组:不同浓度的β-AR激动剂异丙肾上腺素组（ISO,0.01μmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L）;（4）不同浓度的β1-AA组（0.01μmol/L,0.1μmol/L,1μmol/L）;（5）β1-AA（0.1μmol/l）+β1-AR抗原肽段组（3μmol/L）;2.3.4为了观察不同干预对β1-AA对ConA激活的T淋巴细胞增殖的影响分为以下10组（1）β1-AA（0.1μmol/l）+β1-AR阻断剂Atenolol组（1μmol/l）;（2）β1-AA（0.1μmol/l）+β2-AR阻断剂ICI118,551组（1μmol/L）;（3）β1-AA（0.1μmol/l）+β1/β2-AR阻断剂Nadolol组（1μmol/L）;（4）β1-AA（0.1μmol/l）+β-AR阻断剂Propranolol组（1μmol/L）;（5）β1-AA（0.1μmol/l）+PKA抑制剂H-89（1μmol/L）;（6）β1-AA（0.1μmol/l）+PKC抑制剂Chelerythrine Chloride（1μmol/L）;（7）β1-AA（0.1μmol/l）+PKA抑制剂H-89（1μmol/L）+PKC抑制剂Chelerythrine Chloride（1μmol/L）;（8）β1-AA（0.1μmol/l）+L-Ca通道阻断剂维拉帕米（1μmol/l）（9）β1-AA（0.1μmol/l）+IP3受体阻断剂肝素（1μmol/l）（10）β1-AA（0.1μmol/l）+钙释放活化的Ca2+通道（CRCA）阻断剂SKF96365（1μmol/l）2.3.5为了观察单独的阻断剂对T淋巴细胞增殖的影响分为以下6组（1）β1-AR阻断剂Atenolol组（1μmol/l）;（2）β2-AR阻断剂ICI118,551组（1μmol/L）;（3）β1/β2-AR阻断剂Nadolol组（1μmol/L）;（4）β-AR阻断剂Bupranolol组（1μmol/L）;（5）PKA抑制剂H-89（1μmol/L）;（6）PKC抑制剂Chelerythrine（1μmol/L）;2.4用CCK-8法检测大鼠T淋巴细胞增殖将上述加入各种干预的T淋巴细胞置5%CO2、37℃恒温培养箱中刺激培养48h,之后每孔加入10μL CCK-8,继续培养2h后,由于生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比,在酶标仪上于波长λ=450nm处读取各孔的OD值,进行细胞增殖分析,以上各组重复8次。2.5 ELISA法测定T淋巴细胞cAMP水平以及细胞培养上清中IL-2、IFN-γ及IL-4含量将标准品和样品100μL加入酶标板中,置37℃孵育6090min;用洗板液充分洗板4次;每孔加酶标抗体工作液,置37℃孵育6090min;用洗板液充分洗板4次;每孔加底物工作液,置37℃避光反应15min;用洗板液充分洗板4次;每孔加终止液,混匀后即刻于酶标仪450nm波长处测量OD值。2.6 T淋巴细胞胞浆中钙离子水平的测定采用前述方法分离的大鼠T淋巴细胞ConA刺激后,取细胞悬液,在避光条件下,加入钙荧光指示剂Fluo-3/AM（3μmol/L）37℃孵育30min,之后用PBS液漂洗3次,每次5min,静置10min。将负载了Fluo-3/AM指示剂的淋巴细胞悬液加入共聚焦专用皿中,采用激光扫描共聚焦扫描显微镜（Olympus,FV1000）进行观察,荧光强度（F值）来表示胞浆中钙离子水平。结果1大鼠脾脏CD3+T淋巴细胞分选成功首先将用免疫磁珠分选的大鼠CD3+T淋巴细胞用抗FITC-CD3+的抗体通过流式细胞仪进行鉴定,结果发现T淋巴细胞占到92.2%（图2-1）;随后,用Guava流式细胞分析仪进行细胞活性测定,分选后的活细胞>95%,光镜下细胞形态均一,提示T淋巴细胞分选成功（图2-2,2-3）。2大鼠T淋巴细胞表面无β1-AR的表达为了进一步验证在大鼠T淋巴细胞表面是否表达β1-AR,本研究利用免疫荧光化学技术发现:DAPI染色的淋巴细胞的核呈兰色,在阴性对照组（图2-4A）和实验组（图2-4B）均没有检测到FITC标记二抗的绿色荧光。提示:在大鼠的脾脏T淋巴细胞表面没有检测到β1-AR的表达。3β1-AA对免疫磁珠分选后未经ConA激活的大鼠T淋巴细胞增殖没有影响由于用免疫磁珠分选的大鼠T淋巴细胞中,除了含有大量的T（90%-95%）外,含有少量的其他单核细胞,同样为了检测β1-AA对T细胞以及其他单核细胞是否有直接作用,我们将β1-AA直接加入免疫磁珠分选后的细胞,发现:β1-AA对这些细胞的增殖没有作用（P>0.05）（图2-5）4 ConA可以促进大鼠脾脏T淋巴细胞的增殖免疫磁珠分选的大鼠T淋巴细胞中加入ConA后,OD值达到0.38±0.04,明显高于未加ConA的对照组的0.18±0.05（P<0.01）,提示ConA可以激活大鼠T淋巴细胞（图2-6）。5β1-AA可以浓度依赖性的促进ConA激活的大鼠脾脏T淋巴细胞的增殖在ConA激活的T淋巴细胞中,分别加入0.01,0.1,1μM的β1-AA,结果发现:OD值分别由原先的0.37±0.04,0.38±0.06,0.42±0.04升高到0.50±0.04,0.61±0.02,0.68±0.05（ P<0.01; P<0.01; P<0.01）,提示β1-AA可浓度依赖性地促进T淋巴细胞增殖（见图2-7）。从阴性血清中提取的IgGs不能促进T淋巴细胞的增殖;β1-AR细胞外第二环与该抗体进行预孵育,中和抗体后,该抗体促进T淋巴细胞的增殖作用消失（图2-8）。6β1-AA促进大鼠T淋巴细胞的增殖的途径为了进一步验证β1-AA促进T淋巴细胞增殖是否可以通过β2-AR,本研究发现:β1-AR阻断剂Atenolol对β1-AA的促增殖作用没有影响,但是可以被β2-AR阻断剂ICI118,551、β1-AR和β2-AR的拮抗剂Nadolol以及非特异性的β-AR阻断剂Bupranolol完全阻断;单独的Atenolol、ICI118,551、Nadolol以及Bupranolol对T淋巴细胞的增殖没有作用（图2-9A,B）,这一结果提示β1-AA促进T淋巴细胞的增殖作用可以通过β2-AR。加入β1-AA后,大鼠脾脏T淋巴细胞胞浆中cAMP水平升高,但是β1-AR阻断剂Atenolol对于cAMP的升高没有影响,并且这种cAMP的升高可以被β2-AR阻断剂ICI118,551、β1-AR和β2-AR的阻断剂Nadolol完全阻断（图2-10）;进一步的研究发现,PKA的阻断剂H-89以及PKC的抑制剂chelerythrine均只能部分阻断β-AA诱导的T淋巴细胞的增殖;而PKA的抑制剂H-89和PKC的抑制剂chelerythrine共同作用,可以完全抑制β-AA诱导的T淋巴细胞的增殖（图2-11）。这一结果提示:β1-AA刺激大鼠脾脏T淋巴细胞的增殖可能主要是通过β2-AR-cAMP-PKA/β2-AR-PKC途径。7钙离子在β1-AA促进T淋巴细胞增殖中的作用7.1β1-AA可以促进ConA激活的大鼠脾脏T淋巴细胞胞内钙的明显升高在ConA刺激的大鼠脾脏T淋巴细胞中加入β1-AA后,胞内的钙离子的平均荧光强度F值由200±8.5升高到628±25（P<0.01）,并且,β1-AA升高胞内钙的作用可以基本被β2-AR受体阻断剂ICI118,551完全阻断（P>0.05）（图2-12,2-13）。这一结果提示:β1-AA可以通过激活β2-AR使淋巴细胞中的胞内钙水平升高。7.2阻断胞浆中钙离子的水平的升高可以不同程度抑制β1-AA诱导的T淋巴细胞的增殖为进一步研究钙离子在β1-AA促进ConA刺激T淋巴细胞增殖中的作用,本研究将ConA激活的T淋巴细胞分别用L-型钙通道阻断剂维拉帕米、内质网膜IP3受体（ IP3 R）阻断剂肝素以及CRAC通道抑制剂SKF96365预处理后,发现:β1-AA的促进T淋巴细胞增殖作用可以被部分抑制。（图2-14）8β1-AA可以促进大鼠T淋巴细胞分泌IL-2、IFN-γ及IL-4水平升高β1-AA（0.01,0.1,1μM）可浓度依赖性地促进大鼠T淋巴细胞分泌IL-2、IFN-γ及IL-4水平升高（图2-15A,2-16A,2-17A）;这种细胞因子水平的升高不能被β1-AR阻断剂Atenolol阻断,可以被β2-AR受体阻断剂ICI118,551以及β1-AR和β2-AR的阻断剂Nadolol、β-AR的非特异性阻断剂Bupranolol完全阻断（图2-15B,2-16B,2-17B）。小结二1.β1-AA可以通过β2-AR-cAMP-PKA/β2-AR-PKC通路促进大鼠脾脏T淋巴细胞的增殖。2.β1-AA可以通过促进大鼠T淋巴细胞胞浆中钙离子水平升高进而促进T淋巴细胞的增殖。3.β1-AA可以促进大鼠T淋巴细胞分泌IL-2、IFN-γ、IL-4分泌增加。第三部分β1-AA促进ConA激活的人外周血T淋巴细胞的增殖和分泌功能研究目的以免疫磁珠分选的人外周血T淋巴细胞为研究对象,研究β1-AA对人外周血T淋巴细胞增殖和分泌功能的影响,同时探索其作用途径。材料与方法1.实验对象健康成人外周血。2.实验方法2.1人外周血CD3+T淋巴细胞的分选采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞;并用免疫磁珠分选CD3+ T淋巴细胞。2.2实验分组2.2.1观察β1-AA对分选的淋巴细胞增殖的影响（1）溶剂对照组:分选的淋巴细胞加入溶剂生理盐水;（2）β1-AA处理组:分选的淋巴细胞直接加入β1-AA。2.2.2观察β1-AA对分选的T淋巴细胞活化特性的影响（1）溶剂对照组:分选的T淋巴细胞加入溶剂生理盐水。（2）ConA组:给予分选的T淋巴细胞5μg/mL ConA预刺激72h。将激活的T淋巴细胞悬液均匀接种于96孔细胞培养板（100μL/孔）,每孔分别加入20μL各种干预因素:2.2.3观察β1-AA对ConA激活的T淋巴细胞是否有促增殖作用（1）溶剂对照组:生理盐水;（2）阴性对照:β1-AA阴性血清IgGs组（0.1μmol/L）;（3）阳性对照组:不同浓度的β-AR激动剂异丙肾上腺素组（ISO,0.01μmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L）;（4）不同浓度的β1-AA组（0.01μmol/L,0.1μmol/L,1μmol/L）;（5）β1-AA（0.1μmol/l）+β1-AR抗原肽段组（3μmol/L）;2.2.4观察不同干预对β1-AA对ConA激活的T淋巴细胞增殖的影响（1）β1-AA（0.1μmol/l）+β1-AR阻断剂Atenolol组（1μmol/l）;（2）β1-AA（0.1μmol/l）+β2-AR阻断剂ICI118,551组（1μmol/L）;（3）β1-AA（0.1μmol/l）+β1/β2-AR阻断剂Nadolol组（1μmol/L）;（4）β1-AA（0.1μmol/l）+β-AR阻断剂Propranolol组（1μmol/L）;（5）β1-AA（0.1μmol/l）+PKA抑制剂H-89（1μmol/L）;（6）β1-AA（0.1μmol/l）+PKC抑制剂Chelerythrine Chloride（1μmol/L）;（7）β1-AA（0.1μmol/l）+PKA抑制剂H-89（1μmol/L）+PKC抑制剂Chelerythrine（1μmol/L）;2.2.5观察单独的阻断剂对T淋巴细胞增殖的影响（1）β1-AR阻断剂Atenolol组（1μmol/l）;（2）β2-AR阻断剂ICI118,551组（1μmol/L）;（3）β1/β2-AR阻断剂Nadolol组（1μmol/L）;（4）β-AR阻断剂Bupranolol组（1μmol/L）;（5）PKA抑制剂H-89（1μmol/L）;（6）PKC抑制剂Chelerythrine（1μmol/L）;2.3 Cell Counting Kit-8 （CCK-8）法检测人外周血T淋巴细胞的增殖见第二部分2.4采用ELISA试剂盒检测T淋巴细胞cAMP水平以及细胞培养上清中IL-2、IFN-γ、IL-4含量见第二部分结果1β1-AA对分选的无ConA刺激的人T淋巴细胞增殖无影响由于用免疫磁珠分选的人T淋巴细胞中,除了含有大量的T（90%-95%）淋巴细胞外,还含有少量的其他单核细胞,为了检测β1-AA对T淋巴细胞以及少量单核细胞是否有直接作用,我们将β1-AA直接加入免疫磁珠分选后的细胞,发现:β1-AA对这些细胞的增殖没有影响（P>0.05）（图3-1）。2 ConA可以促进人外周血T淋巴细胞的增殖免疫磁珠分选的人外周血T淋巴细胞中加入ConA后,未加ConA的对照组的OD值由原先的0.13±0.04升高到0.38±0.06（P<0.01）（图3-2）,提示ConA可以激活人外周血T淋巴细胞。3β1-AA可以促进ConA激活的人外周血T淋巴细胞增殖3.1β1-AA可以浓度依赖性的促进ConA激活的人外周血T淋巴细胞的增殖我们分别将浓度为0.01μM,0.1μM,1μM的β1-AA加入ConA刺激的人外周血T淋巴细胞中,经CCK-8法检测,发现OD值分别由加入前的0.39±0.04,0.40±0.03,0.42±0.04,增加为0.47±0.05（P<0.05）,0.61±0.04 （P<0.01）和0.67±0.05（P<0.01）（见图3-3）,提示β1-AA可以浓度依赖性地促进ConA刺激的人外周血T淋巴细胞增殖。为了证实该抗体作用的特异性,本研究选用从阴性血清中提取的IgGs作为阴性对照作用于ConA刺激的T淋巴细胞,发现OD值0.38±0.04改变为0.40±0.01（P>0.05）,提示此种IgG不能促进ConA刺激T淋巴细胞的增殖;用合成的β1-AR-ECII与该抗体进行预孵育,将β1-AA中和后,OD值由单纯加入自身抗体时的0.61±0.04变化为0.39±0.009,提示β1-AA促进T淋巴细胞的增殖作用消失（P<0.01）（图3-4）。以上结果提示,β1-AA可以促进ConA激活的人外周血T淋巴细胞的增殖。3.2β1-AA促进ConA激活的人外周血T淋巴细胞增殖的可能机制4.2.1β1-AA促进ConA激活的人外周血T淋巴细胞的增殖可以通过β1-AR-cAMP-PKA途径为了探讨β1-AA对T淋巴细胞的增殖作用是否通过β1-AR-cAMP-PKA途径,本研究进行了以下实验。将ConA激活的T淋巴细胞分别采用β1-AR阻断剂Atenolol和β-AR阻断剂Bupranolol预处理后,发现OD值由0.61±0.04分别变化为0.50±0.05（P<0.05）和0.40±0.03（P<0.01）,提示β1-AA的促增殖作用不能被β1-AR的阻断剂Atenolol完全阻断,但可以被β-AR阻断剂Bupranolol完全阻断（图3-5A）;单独的Atenolol和Bupranolol对T淋巴细胞的增殖没有影响（P>0.05） （图3-5B）,这一结果提示,β1-AA促进ConA激活的T淋巴细胞的增殖效应可以部分通过β1-AR发挥。加入β1-AA后,胞浆中cAMP水平由加入前的120±6.8 pmol/mL增加为300±7.5pmol/mL（P<0.01）,提示β1-AA可以使胞浆中cAMP水平升高,再分别加入β1-AR的阻断剂Atenolol和β-AR阻断剂Bupranolol以后,cAMP水平分别改变为201±8.3（P<0.05）和125±8.9（P<0.01）,提示CAMP水平的升高不能被β1-AR阻断剂Atenolol完全阻断,但可以被β-AR阻断剂Bupranolol完全阻断（图3-6）;进一步的研究发现,PKA的抑制剂H-89也只能部分降低β1-AA促进的T淋巴细胞的增殖效应,OD值由0.61±0.04变化为0.51±0.03（P<0.05）（图3-7A）,而单独的H-89对ConA刺激的T淋巴细胞的增殖没有影响（P>0.05）（图3-7B）。这一结果提示:β1-AA有可能部分通过β1-AR-cAMP-PKA途径,促进ConA激活的人外周血T淋巴细胞的增殖。除了此途径外,可能还有其他通路参与。3.2.2β1-AA促进ConA激活的人外周血T淋巴细胞的增殖可以部分通过β2-AR-cAMP-PKA途径为了进一步分析β1-AA促进人外周血T淋巴细胞增殖的作用途径,本研究将β2-AR阻断剂ICI118,551以及β1-AR和β2-AR阻断剂Nadolol分别作用于β1-AA处理的的T淋巴细胞,发现其促增殖作用也只能被ICI118,551部分阻断,但是,Nadolol可以完全阻断β1-AA的促T淋巴细胞的增殖作用（图3-8A）,阻断剂本身对ConA激活的T淋巴细胞增殖没有影响（图3-8B）,这一结果提示β1-AA的促增殖作用可以通过β2-AR进行。而且升高的cAMP水平不能被ICI118,551完全阻断,但可以被Nadolol完全阻断（P>0.05）（图3-9）。这一结果提示:β1-AA促进ConA激活的人T淋巴细胞的增殖效应除了通过β1-AR外,还有β2-AR-cAMP-PKA途径参与。3.2.3β1-AA促进ConA激活的人外周血T淋巴细胞的增殖还可以通过β1/β2-AR-PKC途径鉴于β1-AA的促增殖作用不能完全被PKA抑制剂H-89所完全阻断,本研究选用PKC的抑制剂chelerythrine（白屈菜赤碱）作用于T淋巴细胞,发现其可以部分抑制β1-AA促进的T淋巴细胞的增殖作用。进一步的研究发现,PKC和PKA的抑制剂共同干预也可以完全抑制β1-AA促进的T淋巴细胞的增殖（图3-10）。由于β1/β2-AR的激活均可以激活PKC,那么,在β1-AA促进人T淋巴细胞的增殖过程中涉及到的PKC是来自β1-AR还是β2-AR的激活,本课题进行了如下实验:首先将β2-AR受体途径阻断（ICI118,551）,再加入PKA的抑制剂H-89,发现,β1-AA的促增殖作用不能完全阻断,继续加入PKC抑制剂chelerythrine后,β1-AA的促增殖作用才可完全被阻断（图3-11）。而先将β1-AR受体途径阻断（Atenolol）,然后再加入H-89,也发现β1-AA的促增殖作用不能完全阻断,再加入chelerythrine后,其增殖作用才可完全被阻断（图3-12）。这一结果提示:β1/β2-AR-PKC通路也是β1-AA促进ConA激活的人外周血T淋巴细胞增殖的途径之一。4β1-AA可以促进ConA激活的人外周血T淋巴细胞的分泌功能T淋巴细胞不同功能的发挥取决于分泌细胞因子的种类,本研究检测了IL-2,IFN-γ以及IL-4的分泌水平来反映机体细胞免疫和体液免疫功能。我们将不同浓度（0.01,0.1,1μM）的β1-AA分别作用于ConA刺激的人外周血T淋巴细胞,发现IL-2的分泌水平由加入前的26.3±3.1pg/ml,25.0±2.5 pg/ml,26.8±2.8pg/ml分别增加为33.2±2.4pg/m（lP<0.05）,42.0±3.0pg/ml（ P<0.01）和51±2.8pg/ml（P<0.01）,IFN-γ的分泌水平由43±3.2pg/ml,44±2.5pg/ml,46±4.1pg/ml增加为53±2.6pg/ml（P<0.05）,68±3.0pg/ml（P<0.01）和73±3.4pg/ml（P<0.01）,IL-4的分泌水平增加为33.0±3.2pg/ml（P<0.05）,48.0±4.2pg/ml（P<0.01）和51±3.9pg/ml（P<0.01）,远高于处理前的24.0±2.6pg/ml,22±3.1 pg/ml和23±3.7pg/ml,提示β1-AA可浓度依赖性地促进ConA刺激的人外周血T淋巴细胞分泌IL-2、IFN-γ以及IL-4水平（图3-13A,3-14A,3-15A）。但是,从阴性血清中提取的IgGs不能促进这些细胞因子的生成增加,β1-AA促进T淋巴细胞分泌这些细胞因子的作用可以被β1-AR细胞外第二环的抗原肽段中和（图3-13B,3-14B,3-15B）,提示:β1-AA可以促进这些细胞因子的分泌。并且,这些细胞因子水平的升高可以分别被β1-AR的选择性阻断剂Atenolol和β2-AR的阻断剂ICI118,551部分阻断;可以被β-AR的阻断剂Bupranolol以及β1-AR和β2-AR阻断剂Nadolol完全阻断（图3-13C,3-14C,3-15C）,提示:β1-AA可以通过β1/β2-AR促进这些细胞因子的分泌。小结三1.β1-AA能够浓度依赖性促进ConA刺激的人外周血T淋巴细胞增殖,并且这种作用可能是通过激活β1-AR和β2-AR（β1/β2-AR）两条途径实现的。2.β1-AA可以通过β1/β2-AR促进人外周血T淋巴细胞的分泌功能。