论文摘要
肝移植是目前治疗终末期良性肝病的效治疗手段。肝移植的理想目标是要达到移植肝和受体之间的免疫耐受,既在低免疫抑制或无免疫抑制的情况下移植物仍然功能正常。免疫抑制剂的使用短期内能改善急性排斥症状,但不能保证移植物长期存活,此外免疫抑制剂的长期使用常导致严重的副作用,因此我们寻找有效的在不使用免疫抑制剂的情况下,使受者机体对于移植物产生特异性的耐受已经成为移植免疫学领域最为关注的问题方法,因此,本研究通过对树突状细胞及其基因工程改造,探讨它们与肝移植耐受的关系,从而为无限期延长移植物的存活提供新的治疗方案。在免疫耐受的诱导中,树突状细胞（dendritic cell, DC）起重要的作用,现在已知DC是体内功能最强的抗原提呈细胞（Antigen Presenting Cells,APC）,在机体的特异性免疫中起着非常重要的作用。目前研究证实,DC在启动免疫反应和诱导免疫耐受起决定性作用,这取决于其成熟状态,不成熟DC表面缺乏或低表达MHC分子和共刺激分子,导致T细胞的无能和低反应,从而诱导抗原特异性免疫耐受,而成熟DC表面高表达MHC分子和共刺激分子能激活参与免疫反应的淋巴细胞的增生,因此对DC进行改造以诱导移植免疫耐受成为研究的热点和关键领域。白介素-10 （interleukin-10, IL-10）可抑制Th-1激活的抗原提呈细胞合成细胞因子,阻止单核巨噬细胞活化和抗原提呈细胞的功能。因此,可以抑制炎性免疫反应和T细胞介导的免疫反应。从而减轻免疫排斥反应有很重要的意义。转化生长因子-β1 （Transforming growth factor-β1, TGF-β1）是一种强效免疫抑制因子,它可以抑制细胞毒性T淋巴细胞的增殖和活化,抑制T, B淋巴细胞的增殖及免疫球蛋白的分泌,调节多种细胞因子如IL-1, IL-2的生成并拮抗它们的功能。因此,它在移植免疫过程中,对移植物的长期存活和移植物的耐受密切相关。由于IL-10和TGFβ1既是诱导耐受DC形成的重要细胞因子,又是参与诱导移植耐受的重要细胞因子,所以我们通过从大鼠骨髓分离造血前体细胞体外诱导培养足够数量的DC,构建IL-10和TGFβ1重组质粒,并将其单个和联合转染大鼠imDC,研究IL-10和TGFβ1单个和联合转染后的imDC输注后在受者体内的迁移途径,以及对于同种异体大鼠移植肝的排斥反应级别和存活时间的影响,探讨它们诱导移植耐受的机制。目的通过基因工程改造DC,建立肝移植动物模型,构建IL-10和TGFβ1重组质粒,研究IL-10和TGFβ1单个和联合转染的DC输注受者体内的迁移途径,以及对于同种异体大鼠移植肝的排斥反应级别和存活时间的影响,探讨DC诱导移植耐受的机制,为临床治疗移植免疫排斥提供了有力的实验基础和有关理论上的依据。方法1.DA大鼠DC的诱导、培养及鉴定:用不同细胞因子诱导培养大鼠骨髓来源的造血前体细胞成为成熟DC（mature DC,mDC）和不成熟DC（immature DC,imDC）,利用电镜等进行形态学观察鉴定、利用流式细胞法和免疫组化法进行表型鉴定,利用混合淋巴细胞反应和动物体内直接注射DC进行功能学鉴定。2.构建、筛选、扩增、抽提和鉴定pIRES2-EGFP-hIL-10和pIRES2- EGFP-hTGFβ1真核表达质粒:（1）RT-PCR扩增人IL-10基因,1%琼脂糖凝胶电泳分离、回收PCR产物,含pIRES2-EGFP空载体,经Xho I和EcoR I双酶切后,T4 DNA连接酶连接,将产物转化于DH5a感受态细胞。挑取单克隆菌落进行扩增培养提质粒,以Xho I和EcoR I进行双酶切鉴定。将双酶切为阳性的质粒pIRES2-EGFP-hIL10送公司测序。（2）hTGFβ1构建方法同前,以Bgl II和Hind III进行双酶切鉴定。（3）用中抽试剂盒抽提质粒,以紫外分光光度计测定质粒的浓度。3.脂质体介导的pIRES2-EGFP-hIL-10和pIRES2-EGFP-hTGFβ1单个和联合转染imDC细胞:收集培养6天的imDC,按照Lipofectamine2000使用说明进行转染。实验设立空载体转染组、IL-10、TGFβ1转染组和共转染组,48hr荧光倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白在imDC中的表达。4.用5种方法检测转染后各组imDC分子表型和免疫功能的变化:（1）ELISA法和（2）Western Blot法检测转染后各组imDC培养上清IL-10、TGFβ1蛋白表达;（3）流式细胞法检测各组imDC表面分子CD80、CD86表达情况;（4）免疫细胞化学法检测各组imDC MHCⅡ分子表达情况;（5）混合淋巴细胞反应法检测各组imDC对T细胞的增殖作用。5.大鼠肝移植模型构建:受体为Lewis大鼠,供体为DA大鼠,采用二袖套法建立肝移植模型。6.IL-10、TGFβ1单基因和联合转染的DC输注对于同种异体Lewis大鼠移植肝耐受的实验研究:（1）探讨pIRES2-EGFP-DC腹腔和尾静脉输注后在受体Lewis体内的迁移途径以及微嵌合体形成的机制;（2）IL-10、TGFβ1单基因和联合转染的imDC移植前5d输注受体Lewis大鼠体内,移植后分别于3d、7d、10d :1)检测肝功能;2)ElASA法检测各组IL-12水平;3)肝脏苏木精伊红（HE）染色及急性排斥反应病理评分;4)TUNEL法检测肝脏、脾和淋巴结采用淋巴细胞的凋亡情况。（3）观察各组大鼠肝移植后的生存时间。7.统计学处理:应用SPSS10 .0软件进行单因素方差分析,p<0.05为具有显著性差异。结果1.DC的培养及鉴定:（1）形态学观察:DC细胞形态不规则,大多数细胞表面有细长树枝状突起;（2）mDC和imDC表面均表达表面分子OX62,而表面分子CD86在imDC表面低表达,在mDC表面高表达;（3）imDC和mDC与淋巴细胞相互作用,证实imDC对淋巴细胞的增殖作用弱,而mDC对淋巴细胞的增殖有明显的促进作用;（4）注射mDC的肝移植大鼠在移植后较早且出现较强的急性排斥反应,而注射imDC的大鼠在移植后7天才开始出现轻度急性排斥反应,注射imDC的受体大鼠的存活时间显著长于注射mDC的受体大鼠,这也说明imDC能诱导移植耐受,而mDC能诱导移植排斥反应。2.构建、筛选、扩增和鉴定pIRES2-EGFP-hIL-10和pIRES2- EGFP-hTGFβ1真核表达质粒:（1）琼脂糖凝胶电泳结果显示,PCR扩增产物大小同预期结果一致;（2）重组质粒pIRES2-EGFP-hIL-10、TGFβ1酶切后显示两个条带,IL-10和TGFβ1大小分别为540bp和399bp;（3）IL-10和TGFβ1质粒测序结果经Genebank的序列比对,两重组目的基因序列完全正确;（4）pIRES2-EGFP-hIL-10浓度360ug/ml,pIRES2-EGFP-hTGFβ1浓度126ug/ml,pIRES2-EGFP浓度382ug/ml。3.脂质体介导的pIRES2-EGFP-hIL-10和pIRES2-EGFP-hTGFβ1单个和联合转染imDC细胞:（1）转染48h后在荧光显微镜下可见绿色荧光,转染效率为30%。4.检测转染后各组imDC分子表型和免疫功能的变化:（1）ELISA试剂盒检测转染后各组imDC培养上清,发现转染组目的蛋白表达明显高于未转染组和空载体组。（2）Western Blot检测IL-10和TGFβ1基因转染的imDC上清中均有相应蛋白的高表达,共转染组DC上清能同时检测到IL-10和TGFβ1蛋白的高表达,空载体组imDC的上清几乎不表达TGFβ1蛋白,低表达IL-10蛋白。（3）流式细胞法检测证实,CD80和CD86在mDC表达高于imDC及各基因转染组和空载体组;（4）免疫细胞化学染色hIL-10和TGFβ1基因单个和联合转染imDC MHCⅡ呈低表达,而空载体imDC的MHCⅡ分子表达高于各基因转染组;（5）混合淋巴细胞反应证实IL-10组、TGFβ1组以及共转染组的imDC对T的增值有抑制作用,显著低于空载体组和imDC组。各转染组对T细胞增值的抑制作用以共转染组为最低。imDC组和空载体组对T细胞增殖显著低于mDC对T细胞的增殖能力（P<0.05）。5.大鼠肝移植模型构建:利用二袖套法构建受体为Lewis大鼠供体为DA的大鼠肝移植模型,符合原设计的实验方案。6.pIRES2- EGFP–DC经尾静脉和腹腔输注Lewis大鼠,发现供者DC （EGFP阳性）主要分布于受者脾动脉周围淋巴鞘和边缘区以及淋巴结的副皮质区。7.IL-10、TGFβ1单基因和联合转染的imDC输注对于同种异体大鼠移植肝耐受的实验研究:（1）肝功能检测表明:IL-10组、TGFβ1组和共转染组移植后3d、7d、10d的肝功能优于空载体组;（2）ElASA检测表明:mDC和空白对照组移植后IL-12值明显增高,与其它各组有显著性差异。实验组血清IL-12浓度均低于对照组、mDC组、imDC组及空载体组,实验组中以共转染组最低。（3）急性排斥反应评分表明:mDC组较移植后3天就出现轻度急性排斥反应,7d后出现重度排斥反应,较空白组早出现,且程度重。而空载体组和imDC组移植7d才开始出现轻度排斥,实验组中IL-10组和TGFβ1组移植7天出现交界性排斥反应,移植10d后才出现轻度排斥反应。而共转染组在移植后10d均未出现急性排斥反应;（4）TUNEL染色表明:各组DC输注3d、7d、10d脾动脉周围淋巴鞘和边缘区以及淋巴结的副皮质区可见凋亡细胞细胞,各组凋亡细胞中以mDC最最少,而IL-10和TGFβ1基因转染组淋巴细胞凋亡明显增高;mDC组大鼠肝移植后汇管区仅有少量淋巴细胞凋亡, imDC组汇管区淋巴细胞凋亡高于mDC组,但低于IL-10和TGFβ1基因转染组。在基因转染组中,以共转染组汇管区淋巴细胞凋亡为最多。同时,在移植3d、7d、10d中,mDC组凋亡细胞逐渐消失,而转染组的凋亡细胞数量逐渐递增。（5）肝移植后生存时间观察表明:mDC组大鼠绝大部分在肝移植后一周内死亡,空白组大鼠在12内全部死亡,imDC组和空载体转染组大鼠在移植后30天内因持续排斥死亡,实验组由于转染IL-10和TGFβ1基因,存活时间明显延长。IL-10组大鼠移植后存活时间绝大部分接近一个月。TGFβ1组大鼠移植后存活又显著长于IL-10组,大部分在50天左右,最长的甚至活到79天。共转染组的大鼠除一只生存时间是75天,其余的存活时间超过3个月。结论1.本实验已成功利用细胞因子从大鼠骨髓造血干细胞诱导出足够数量的mDC和imDC。同时,mDC和imDC具有不同的生物学特性。2.我们在成功构建pIRES2-EGFP-hIL-10和pIRES2-EGFP-hTGFβ1真核表达质粒的基础上,采用脂质体法成功转染imDC,可以获得良好的转染效率。转入的基因可以在imDC内表达,并且使imDC的生物学特性发生相应的改变。3.本实验采取基因共转染技术,发现IL-10和TGFβ1共转染对诱导大鼠移植免疫耐受作用和延长移植大鼠存活时间明显优于单基因转染组,而IL-10和TGFβ1基因单基因转染组诱导免疫耐受作用优于未转染组。IL-10和TGFβ1基因联合应用在诱导器官移植耐受有应用前景。