昆虫病原线虫共生菌YL001的分子鉴定及杀虫毒性基因的克隆

论文摘要

昆虫病原线虫共生菌是共生于昆虫病原线虫（entomopathogeic nematodes, EPNs）肠道内的一类细菌,在EPNs中对昆虫的致病力起关键性作用,与线虫之间的关系可以概括为:线虫携带共生菌进入寄主昆虫体内,并释放到昆虫的血腔中;共生菌在昆虫血腔内繁殖,产生杀虫活性极高的蛋白毒素,使昆虫患败血症,一般在48h内死亡。由于这类杀虫毒素蛋白具有高效、杀虫谱广和杀虫迅速等诸多优点,从共生菌中克隆杀虫毒性基因用于开发新型生物源杀虫物质,以延缓害虫对目前使用的杀虫物质产生的抗性,已成为当今的研究热点。昆虫病原线虫共生菌已成为一类有待开发的生物资源,基于此,昆虫病原线虫共生菌的分类鉴定是开展相关研究的基础。分子鉴定:昆虫病原线虫共生菌YL001是西北农林科技大学无公害农药研究中心分离得到的一株有较强杀虫活性的共生菌,其分子鉴定是根据目前已知16S rDNA基因,设计引物对P1P2,以YL001菌株的总DNA为模板进行PCR扩增,产物大小为568bp,GenBank的接收号为EF206655,此序列与GenBank登录号为XN16RNA0的序列相似性达99.5%。构建系统进化树,显示与Xenorhabdus nematophilus的亲缘关系最近。昆虫病原线虫共生菌YL001与GenBank中现有的昆虫病原线虫共生菌同源序列进行比对,与Xenorhabdus nematophilus的相似形高达99.5%,遗传距离为0.5,进一步证实了该菌株就是Xenorhabdus nematophilus。杀虫毒性基因的克隆:以YL001为材料,根据已报道的杀虫毒素基因-菌毛蛋白亚基序列,设计引物对P3P4,以YL001菌株的总DNA为模板进行PCR扩增,获得特异性片段,并将此片断克隆到T-easy载体上,获得了重组子pGEM-PSYL001,序列测定和分析结果表明,PSYL001阅读框全长537bp,编码179个氨基酸,预测分子质量和等电点分别为18.9ku和6.94,GenBank的接收号为DQ537944。序列比较结果表明,与菌毛蛋白亚基类基因高度同源（同源性达99%）。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 昆虫病原线虫共生菌的概述
• 1.2 共生菌与昆虫病原线虫的关系
• 1.2.1 阶段Ⅰ
• 1.2.2 阶段Ⅱ（早期）
• 1.2.3 阶段Ⅱ（后期）
• 1.2.4 阶段Ⅲ
• 1.2.5 细菌－线虫相互作用中所涉及的基因
• 1.3 昆虫病原线虫共生菌的特性
• 1.3.1 共生菌Xenorhabdus 的生理生化特性
• 1.3.2 昆虫病原线虫共生细菌型态变异
• 1.4 共生菌的分类研究进展
• 1.5 昆虫病原线虫共生菌杀虫毒素蛋白研究进展
• 1.5.1 昆虫病原线虫共生菌杀虫蛋白及其目标害虫
• 1.5.2 昆虫病原线虫共生菌杀虫蛋白基因及来源
• 1.5.3 昆虫病原线虫共生菌杀虫蛋白的杀虫作用机制
• 1.6 昆虫病原线虫共生菌分子鉴定和基因克隆的意义
• 1.6.1 昆虫病原线虫共生菌分子鉴定的意义
• 1.6.2 克隆昆虫病原线虫共生菌杀虫毒性基因的意义
• 第二章 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 试剂
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 昆虫病原线虫共生菌基因组DNA 模板的制备
• 2.2.2 DNA 的PCR 扩增
• 2.2.3 PCR 产物与T 载体的连接
• 2法）'>2.2.4 感受态细胞的制备（CaCl₂法）
• 2.2.5 转化
• 2.2.6 重组质粒的筛选与鉴定
• 2.2.7 序列测定及分析
• 2.2.8 E.coli 质粒的提取
• 2.2.9 BamH I，Hind III 双酶切
• 2.2.10 琼脂糖凝胶电泳回收
• 2.2.11 T4 DNA-lignase 连接
• 2.2.12 BL21-pET28a-PSYL001 表达载体的鉴定
• 2.2.13 目的基因的诱导表达
• 2.2.14 蛋白质的SDS-PAGE 凝胶电泳
• 第三章 结果与分析
• 3.1 昆虫病原线虫共生菌YL001 基因组DNA 的检测
• 3.2 昆虫病原线虫共生菌YL001 的分子鉴定
• 1P₂分子鉴定引物对进行PCR 扩增及其产物的克隆'>3.2.1 利用P₁P₂分子鉴定引物对进行PCR 扩增及其产物的克隆
• 3.2.2 昆虫病原线虫共生菌YL001 的分子鉴定16S rDNA 基因片段的序列
• 3.2.3 分子鉴定16S rDNA 片段序列的同源性分析
• 3.3 菌毛蛋白亚基的克隆与序列分析
• 3.3.1 PSYL001 基因PCR 扩增及其产物的克隆
• 3.3.2 PSYL001 基因的序列分析
• 3.4 PSYL001 基因在大肠杆菌BL21 中的表达
• 3.4.1 pET28a（+）-PSYL001 重组体的构建和鉴定
• 3.4.2 PSYL001 基因的诱导表达
• 3.4.3 PSYL001 基因不表达的原因
• 第四章 讨论
• 4.1 昆虫病原线虫共生菌YL001 的分子鉴定
• 4.2 PSYL001 基因的扩增
• 4.3 PSYL001 基因的克隆和序列分析
• 4.4 研究展望
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介