论文摘要
目的:博莱霉素（bleomycin, BLM）是抗肿瘤的化疗药物,其主要副作用是引起肺泡炎和肺纤维化。气管内一次性滴注BLM复制肺纤维化模型已得到国内外公认。肺损伤是引起肺动脉高压的常见原因。目前对由BLM诱导肺纤维化过程中肺血管的变化所知甚少。本课题组以往研究结果显示:气管内滴注BLM后第14天,大鼠出现肺动脉高压,肺动脉内皮依赖性舒张反应受损;罗格列酮（Rosiglitazone, RSG）—过氧化物酶体增殖活化受体γ（peroxisome prolifertor-actived receptor-γ, PPAR-γ）激动剂能有效地防治BLM诱导的肺动脉高压。现已知,诱导型一氧化氮合酶（ inducible nitro oxide synthase, iNOS）参与肺动脉高压的形成,但iNOS在BLM所致的肺动脉高压形成机制中的作用,尚不清楚。本实验通过观察模型大鼠肺动脉壁iNOS表达、iNOS在肺动脉血管反应性异常中的作用以及RSG对上述变化的影响,为阐明BLM诱导肺动脉高压的机制和RSG的防治机制提供资料。第一部分罗格列酮对博莱霉素所致肺动脉高压大鼠肺动脉iNOS表达的影响方法:选用免疫组织化学方法,观察气管内滴注BLM后第14天,大鼠各级肺动脉iNOS表达和分布的变化及RSG整体治疗以及离体孵育对肺动脉iNOS表达的影响。健康雄性SD大鼠36只,体重（160180g）,随机分为四组:①NS+NS组大鼠（n=6） :一次性气管内滴入生理盐水（normal saline,NS,0.5ml/kg）,NS （2ml/d）灌胃14天;②BLM+NS组（n=18） :一次性气管内滴入BLM （5mg/0.5ml/kg）,NS （2ml/d）灌胃14天;③BLM+RSG组（n=6）:一次性气管内滴入BLM （5mg/0.5ml/kg）,RSG （3mg/kg·d溶于NS2ml/d）灌胃14天;④NS+RSG组（n=6） :一次性气管内滴入NS（0.5ml/kg）,RSG （3mg/kg·d溶于NS2ml/d）灌胃14天。各组大鼠均在气管给药后第14天取材。大鼠在10%水合氯醛（3ml/kg,ip.）麻醉后,放血处死。将肺动脉及左肺置于新鲜配置的4%多聚甲醛溶液中固定。BLM+NS组有6只大鼠的肺动脉立即被置于4%多聚甲醛固定,另12只大鼠的肺动脉在体外孵育（DMEM培养液,37℃,5% CO2 ）24小时后被置于4%多聚甲醛中固定。体外孵育分两组:单纯培养液组（DMEM）和RSG孵育组（DMEM中含RSG10μmmol/L）,每组6只大鼠。固定后的组织经石蜡包埋、切片,用于iNOS免疫组织化学染色。JEDA-801D形态学图像分析系统计算iNOS免疫染色阳性的平均光密度值及阳性面积百分比。整体给药各组肺动脉行HE染色进行形态学观察。结果:1注BLM大鼠肺动脉主干iNOS的表达及RSG的影响NS+NS组肺动脉壁（平滑肌层和内皮）有少量iNOS表达（平均光密度0.29±0.03,阳性面积6.80±1.80）;NS+RSG组肺动脉壁（内皮和平滑肌层）iNOS表达（平均光密度0.30±0.01,阳性面积5.90±1.17）与NS+NS组相比,其差异无统计学意义（P>0.05）。BLM+NS组肺动脉壁（内皮和平滑肌层）iNOS表达（平均光密度0.39±0.02,阳性面积16.82±2.42）明显强于NS+NS组（P<0.01）。BLM+RSG组肺动脉壁（内皮和平滑肌层）iNOS表达（平均光密度0.33±0.02,阳性面积11.03±2.06）弱于BLM+NS组（P<0.05）,但仍强于NS+NS组、NS+RSG组（P<0.05）。离体水平RSG孵育组（DMEM+RSG10μmmol/L）肺动脉壁iNOS表达（平均光密度0.32±0.02,阳性面积11.09±1.58）弱于单纯DMEM孵育组（平均光密度0.39±0.02,阳性面积16.60±2.75）（P<0.05）。2注BLM大鼠肺内动脉iNOS的表达及RSG的影响肺内中等动脉（直径>100μm）: NS+NS组肺内中动脉有少量iNOS表达（平均光密度0.30±0.06,阳性面积4.96±1.00）。与NS+NS组相比,NS+RSG组肺动脉iNOS表达无明显变化（平均光密度0.30±0.01,阳性面积5.02±1.40）（P>0.05）。BLM+NS组肺动脉iNOS表达（平均光密度0.37±0.02,阳性面积16.71±5.00）强于NS+NS组（P<0.05）。BLM+RSG组肺内中动脉iNOS表达（平均光密度0.31±0.01,阳性面积6.19±2.65）弱于BLM+NS组（P<0.05）,并且与NS+NS组、NS+RSG组相比,其差异无统计学意义（P>0.05）。肺内小动脉（直径<100μm）: NS+NS组肺内小动脉有少量iNOS表达（平均光密度0.30±0.05,阳性面积5.27±0.44）。与NS+NS组相比,NS+RSG组肺动脉iNOS表达无明显变化（平均光密度0.30±0.01,阳性面积4.41±0.72）（P>0.05）。BLM+NS组肺内小动脉iNOS表达（平均光密度0.36±0.01,阳性面积17.91±3.07）强于NS+NS组（P<0.01）。BLM+RSG组肺内小动脉iNOS表达（平均光密度0.33±0.01,阳性面积10.32±3.55）弱于BLM+NS组（P<0.05）,但仍强于NS+NS组、NS+RSG组（P<0.05）。3 RSG对BLM所致的肺动脉高压大鼠肺动脉形态学改变的影响光镜下可见NS+NS组、NS+RSG组血管内皮细胞完整,内膜连续,内皮下弹力纤维完整,平滑肌层结构整齐;BLM+NS组肺动脉血管内皮细胞有脱落,内膜不连续,内皮下弹力纤维结构尚可;BLM+RSG组肺动脉内皮细胞损伤较轻,内膜基本完整,内皮下弹力纤维完整。4小结:气管内滴入BLM第14天,大鼠肺动脉iNOS表达明显增加,肺动脉内皮细胞损伤;RSG阻止肺动脉iNOS高表达,减轻肺动脉内皮细胞损伤。第二部分罗格列酮对博莱霉素所致肺动脉高压大鼠肺动脉血管反应性的影响及iNOS的作用方法:采用离体肺动脉血管环张力测定方法和硝基酪氨酸（nitrotyrosine,NT）免疫组化的方法,观察罗格列酮对气管内滴注BLM后第14天大鼠肺动脉血管反应性的影响及iNOS的作用。健康雄性SD大鼠67只,体重（160180g）,随机分为六组:①有内皮NS+NS组（n=9） :一次性气管内滴入生理盐水（normal saline,NS,0.5ml/kg） ,NS （2ml/d）灌胃14天;②无内皮NS+NS组（n=9） :一次性气管滴入NS 0.5ml/kg,NS（2ml/d）灌胃14天,去除肺动脉内皮;③有内皮BLM+NS组（n=7） :一次性气管滴入BLM5mg/0.5ml/kg , NS （2ml/d）灌胃14天④无内皮BLM+NS组（n=7）:一次性气管滴入BLM5mg/0.5ml/kg,NS （2ml/d）灌胃14天,去除肺动脉内皮;⑤有内皮BLM+RSG组（n=9） :一次性气管滴入BLM5mg/0.5ml/kg,RSG （3mg/kg/d溶于NS2ml/d）中灌胃14天;⑥无内皮BLM+RSG组（n=8） :一次性气管滴入BLM5mg/0.5ml/kg,RSG （3mg/kg/d溶于NS2ml/d）中灌胃14天,去除肺动脉内皮。各组大鼠均在气管给药后第14天取材。腹腔注射10%水合氯醛3ml/kg麻醉动物,固定,放血处死动物,迅速摘取心肺,置于4℃新鲜配置的Krebs液中,并通入含95%O2—5%CO2的混合气体。仔细分离左、右侧肺动脉,剪成2-3mm长的肺动脉环（pulmonary artery rings,PARs）。注意避免损伤肺动脉内皮。另外去内皮组在分离出肺动脉后用打磨的玻璃电极轻轻穿入肺动脉腔小心转动去除内皮。将分离后的血管环垂直悬挂于盛有10ml Krebs液的浴槽中,用两个不锈钢针轻轻穿过血管环,一端固定于浴槽底部,另一端连接张力传感器,与3066平台记录仪相连。温度保持在37℃左右,并持续通入上述混合气体。PARs在2g张力下平衡1h,期间每隔15分钟换液一次,用10-6mol/L苯肾上腺素（Phenylephrine, PE）检测PARs的反应性,待收缩反应曲线至平台后冲洗,基础张力稳定后,对有内皮组肺动脉测定:⑴对10-6mol/L PE的收缩反应;⑵对10-6mol/L Ach的舒张反应;⑶选择性iNOS抑制剂氨基胍（Aminoguandine,AG） 10-4mol/L孵育20分钟后,各组PARs对10-6mol/L PE的收缩反应;⑷非选择性NOS抑制剂N （omega） -nitro-L-arginine methly ester （L-NAME） 10-4mol/L孵育20分钟后,各组PARs对10-6mol/L PE的收缩反应。在去内皮组,用10-6mol/L PE预收缩PARs至反应平台后,肺动脉对10-6mol/L Ach的舒张反应消失,说明内皮已去除干净,然后对PARs进行血管张力测定（方法同有内皮组PARs）。实验结束后将PARs烘烤至重量不再变化,记录干重。收缩反应结果用每毫克血管环干重的克张力（g/mg·d·w）表示,舒张反应结果以占PE （10-6mol/L）收缩值的百分比表示。NS+NS组、BLM+NS组、BLM+RSG组各取6只大鼠的肺动脉主干及部分肺组织置于4%多聚甲醛中,石蜡包埋切片用于免疫组织化学。结果:1 RSG对PARs收缩反应变化的影响有内皮BLM+NS组PARs对PE收缩反应（0.67±0.15 g/mg.d.w）较有内皮NS+NS组（0.99±0.28g/mg.d.w）明显减弱（P<0.05）;有内皮BLM+RSG组PARs对PE的收缩反应（1.12±0.36 g/mg.d.w）明显强于有内皮BLM+NS组（P<0.05）,与有内皮NS+NS组相比,其差异无显著性（P>0.05）。无内皮BLM+NS组PARs对PE的收缩反应（0.77±0.22 g/mg.d.w）较无内皮NS+NS组PARs （1.19±0.34 g/mg.d.w）明显降低（P<0.05）;无内皮BLM+RSG组PARs对PE的收缩反应（1.18±0.33 g/mg.d.w）较无内皮BLM+NS组显著增强（P<0.05）,与无内皮NS+NS组相比其差异无显著性（P>0.05）。提示BLM气管滴入导致肺动脉对PE的收缩反应减弱,RSG对肺动脉平滑肌有保护作用,可恢复肺动脉对PE的收缩反应。2 RSG对PARs舒张反应的影响有内皮BLM+NS组PARs对Ach的舒张反应（0.43±0.14）较有内皮NS+NS组PARs （0.93±0.08）显著降低（P<0.01）。有内皮BLM+RSG组PARs对Ach的舒张反应（0.64±0.20）明显高于有内皮BLM+NS组（ P<0.05 ）,但仍低于有内皮NS+NS组（P<0.05）。提示RSG可以部分改善气管内滴入BLM所致的PARs对Ach的舒张反应降低。3 AG （10-4mol/L）孵育对PARs反应性的影响无内皮NS+NS组、无内皮BLM+NS组、无内皮BLM+RSG组PARs在AG孵育前后对PE收缩反应性无明显变化,提示离体情况下肺动脉平滑肌层iNOS-NO对PARs的收缩反应无明显影响。有内皮NS+NS组、有内皮BLM+NS组、有内皮BLM+RSG组PARs在AG孵育前后对PE的收缩反应无明显变化,提示在离体情况下肺动脉内皮iNOS-NO对PARs的收缩反应无明显影响。4 L-NAME （10-4mol/L）孵育对PARs反应性的影响有内皮NS+NS组PARs在L-NAME孵育后对PE的收缩反应与孵育前相比明显增强（1.64±0.53 g/mg.d.w vs 1.08±0.37 g/mg.d.w）（P<0.01） ;有内皮BLM+NS组PARs经L-NAME孵育后对PE的收缩反应与孵育前相比无明显变化（P>0.05）;有内皮BLM+RSG组PARs在L-NAME孵育后对PE的收缩反应与孵育前相比明显增强（1.75±0.39g/mg.d.w vs 1.27±0.40g/mg.d.w , P<0.05）。无内皮NS+NS组、无内皮BLM+NS组、无内皮BLM+RSG组PARs在L-NAME孵育前后对PE的收缩反应性均无明显改变。这表明,BLM+NS组肺动脉内皮损伤严重,RSG可部分恢复BLM所致的PARs内皮依赖性舒张反应降低。提示,RSG可能通过保护肺动脉内皮细胞,维持eNOS的正常功能,而降低肺动脉压。5注BLM大鼠肺动脉主干硝基酪氨酸（nitrotyrosine, NT）的表达及RSG的影响NS+NS组肺动脉壁（平滑肌层和内皮）有极少量NT表达（平均光密度0.31±0.01,阳性面积6.87±0.56）。BLM+NS组肺动脉壁（内皮和平滑肌层）NT表达（平均光密度0.39±0.02,阳性面积21.42±1.84）明显强于NS+NS组（P<0.01）。BLM+RSG组肺动脉壁（内皮和平滑肌层）NT表达（平均光密度0.34±0.01,阳性面积9.80±0.94）弱于BLM+NS组（P<0.05）,但仍强于NS+NS组（P<0.05）。6注BLM大鼠肺内动脉NT的表达及RSG的影响肺内中等动脉（直径>100μm）: NS+NS组肺内中动脉有少量NT表达（平均光密度0.31±0.01,阳性面积5.52±0.83）。BLM+NS组肺动脉NT表达（平均光密度0.38±0.02,阳性面积16.47±1.82）强于NS+NS组（P<0.01）。BLM+RSG组肺内中动脉NT表达（平均光密度0.32±0.02,阳性面积6.23±1.11）弱于BLM+NS组（P<0.01）,与NS+NS组相比,其差异无统计学意义（P>0.05）。肺内小动脉（直径<100μm）: NS+NS组肺内小动脉有少量NT表达（平均光密度0.31±0.01,阳性面积4.89±0.97）。BLM+NS组肺内小动脉NT表达（平均光密度0.40±0.02,阳性面积14.60±2.55）强于NS+NS组（P<0.01）。BLM+RSG组肺内小动脉NT表达（平均光密度0.31±0.01,阳性面积5.54±1.02）弱于BLM+NS组（P<0.05）,与NS+NS组相比,其差异无统计学意义（P>0.05）。小结:BLM气管内滴入可导致肺动脉的收缩反应降低,内皮依赖性舒张反应受损,肺动脉内皮细胞损伤,平滑肌功能异常,肺动脉NT显著增加,这可能是BLM诱导肺动脉高压的机制之一。RSG能够减轻肺动脉氧化损伤,恢复肺动脉的收缩反应,改善内皮依赖性舒张反应,保护肺动脉平滑肌、内皮,维持eNOS的正常功能,这可能是RSG降低BLM诱导的肺动脉高压的机制之一。结论:1气管滴入BLM第14天肺各级动脉iNOS、NT表达明显增强,肺动脉内皮细胞受损。上述异常可能在BLM诱导的肺动脉高压过程中发挥重要作用。2 BLM诱导的肺动脉高压大鼠肺动脉收缩反应降低,内皮依赖性舒张反应受损,导致肺动脉血管反应性紊乱,上述异常可能参与了肺动脉高压的形成。3 RSG降低肺动脉iNOS、NT表达,保护肺动脉内皮细胞,部分恢复eNOS功能,完全恢复肺动脉平滑肌功能,改善肺动脉血管反应性,这可能是RSG降低肺动脉压的机制之一。
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