硫化叶菌超表达载体构建及应用

论文摘要

在硫化叶菌中同源表达、纯化并分析各种重要蛋白质的功能对于研究极端嗜热古菌的生命活动具有重要意义。本研究利用araS启动子和穿梭载体pEXA构建硫化叶菌超表达载体pZC2,成功超表达了带有C端6×His标签序列的DNA双链断裂修复蛋白Mre11,并进一步采用共纯化法鉴定到Mre11蛋白的作用配体Rad50,并确定上述蛋白在高盐浓度（500mM NaCl）下仍能形成MR复合体,表明该复合物在逆性条件下可能仍保持DNA断链修复的功能。进一步共纯化分析表明基因组DNA片段是MR复合体形成的必需条件,在缺乏基因组DNA片段的情况下古菌分子伴侣蛋白结合并可能保护Mre11。因此该表达系统能够有效地应用于鉴定蛋白质的体内作用网络。本研究构建的超表达载体不仅可以表达重要蛋白并研究重要蛋白功能与鉴定重要蛋白的体内作用网络,还可以用于分析古菌翻译起始元件Shine-Dalgarno的功能。古菌的翻译机制比较类似细菌,但是古菌的翻译因子又类似真核生物,有自己独特的性质,故研究古菌的翻译机制对了解物种的进化有重大帮助。迄今为止,直接在古菌体内对翻译起始元件Shine-Dalgarno的功能研究极少。本研究在超表达载体pZC2的基础上构建了硫化叶菌阿拉伯糖操纵子Sso3067基因上游序列中Shine-Dalgarno （GGTGTA）序列双碱基突变的lacS酶活报告质粒,即STlacS- pZC2、SDN1lacS- pZC2、SDN21acS- pZC2、SDN31acS- pZC2,并转化硫化叶菌后检测Shine-Dalgarno序列在体内对翻译效率的影响。结果表明处于操纵子第二个编码框上游的Shine-Dalgarno序列对该编码基因的翻译效率影响重大,并且核心的GGTG序列极其重要。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 1 前言
• 1.1 古菌
• 1.2 硫化叶菌
• 1.3 硫化叶菌遗传体系
• 1.4 Mre11蛋白复合物功能
• 1.5 蛋白质翻译起始
• 1.6 研究目的及内容
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 培养基成分及培养条件
• 2.1.3 主要分子生物学试剂和由公司完成的实验
• 2.1.4 主要仪器
• 2.2 实验方法及原理
• 2.2.1 大肠杆菌DH5α感受态制备和热击转化法
• 2.2.2 硫化叶菌感受态制备和电击转化法
• 2.2.3 提取硫化叶菌总DNA
• 2.2.4 构建硫化叶菌体内表达载体并表达Mre11
• 2.2.5 SDS-PAGE和Western-blot
• 2.2.6 构建含SD序列突变的重组质粒
• 2.2.7 β-galactosidase（LacS）酶活分析
• 2.2.8 MALDI-TOF鉴定
• 3 结果与分析
• 3.1 构建硫化叶菌超表达载体
• 3.2 含有Mre11的硫化叶菌重组质粒
• 3.3 Mre11蛋白Western印迹检测
• 3.4 表达并共纯化Mre11结合蛋自
• 3.5 构建双标签载体表达Mre11蛋白
• 3.6 构建含有SD突变序列的硫化叶菌重组质粒
• 3.7 STlacS-pZC2、SDN1lacS-pZC2、SDN2lacS-pZC2、SDN3lacS-pZC #2电转化及菌株酶活测定
• 4 讨论与展望
• 参考文献
• 附表
• 致谢