建立具有药物代谢酶CYP2C9活性的微生物模型

论文摘要

本文选用人体药物代谢酶CYP2C9代谢的4种药物,分3步建立具有药物代谢酶CYP2C9活性的微生物模型。首先考察了7株真菌对CYP2C9特异性底物甲苯磺丁脲的转化能力,确认小克银汉霉对其转化能力很强且位点专一,与人体中该特异性底物代谢的产物种类和比例一致,由此初步建立了具有药物代谢酶CYP2C9活性的微生物模型。然后以CYP2C9代谢的3种药物为底物,进一步验证初选模型菌株对它们转化的能力与特点,并与人体相关药物代谢结果比较,确认初选模型具有一定的应用广泛性。鉴于短刺小克银汉霉AS 3.910的综合优势,确立其为最佳具有CYP2C9活性的微生物模型菌株。最后利用人体CYP2C9的化学抑制剂对该模型菌株转化特异性底物甲苯磺丁脲的反应做相关抑制实验,从细胞水平验证短刺小克银汉霉AS 3.910具有与CYP2C9活性相似的药物代谢酶,是研究人体CYP2C9药物代谢适宜的体外模型。 一、初步建立CYP2C9活性的微生物模型 甲苯磺丁脲是人体CYP2C9的特异性底物,选用7种丝状真菌为转化菌株,利用高效液相色谱法对转化产物进行定量分析。结果表明,静息细胞与非静息细胞状态的短刺小克银汉霉AS 3.910、AS 3.153和雅致小克银汉霉AS 3.2028对不同浓度的甲苯磺丁脲均有很强的转化能力,形成92%左右的人体CYP2C9特定产物4′-羟基甲苯磺丁脲,证明小克银汉菌属中的3株菌AS 3.910、AS 3.153和AS 3.2028具有与人体CYP2C9活性相似的药物代谢酶,初步建立了具有药物代谢酶CYP2C9活性的微生物模型。鉴于短刺小克银汉霉AS 3.910的综合优势,选其为放大实验的模型菌株,制备出6.5 g 4′-羟基甲苯磺丁脲纯品,纯度大于99%,利用核磁共振方法进一步确证了其化学结构为人体CYP2C9代谢的特定产物4′-羟基甲苯磺丁脲。 二、验证初选具有CYP2C9活性的微生物模型的适用性 以短刺小克银汉霉AS 3.910、AS 3.153和雅致小克银汉霉AS 3.2028为模型

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 药物代谢
• 1.2 药物代谢研究方法
• 1.2.1 体内研究方法
• 1.2.2 体外研究方法
• 1.3 用微生物模型模拟哺乳动物药物代谢
• 1.4 药物代谢与细胞色素P450
• 1.4.1 药物代谢酶细胞色素P450简介
• 1.4.2 参与药物代谢的细胞色素P450酶的研究方法
• 1.4.3 真菌细胞色素P450
• 1.5 建立具有人体CYP2C9活性的微生物模型的意义及研究现状
• 1.5.1 初步建立具有人体CYP2C9活性的微生物模型
• 1.5.2 验证初选具有CYP2C9活性的微生物模型的适用性
• 1.5.3 检测人体CYP2C9化学抑制剂对模型菌株转化特异性底物甲苯磺丁脲的抑制
• 第二章 实验材料与基本方法
• 2.1 微生物
• 2.2 培养基
• 2.3 药品与试剂
• 2.4 仪器设备
• 2.5 微生物转化系统
• 2.5.1 转化菌株孢子和种子的制备
• 2.5.2 基本转化体系
• 2.5.3 放大制备转化系统
• 2.6 样品预处理和代谢产物检测
• 第三章 筛选具有人体CYP2C9活性的微生物模型
• 3.1 甲苯磺丁脲
• 3.2 甲苯磺丁脲的微生物转化方法
• 3.2.1 甲苯磺丁脲非静息和静息转化系统
• 3.2.2 甲苯磺丁脲转化产物的分析
• 3.2.3 静息转化系统同非静息转化系统相比较进行菌种筛选
• 3.2.4 代谢产物的分离与鉴定
• 3.3 微生物转化甲苯磺丁脲结果
• 3.3.1 甲苯磺丁脲的HPLC分析
• 3.3.2 菌种筛选结果
• 3.3.3 代谢产物的分离与鉴定
• 3.4 讨论
• 第四章 验证初选模型的应用性研究
• 4.1 吲哚美辛、格列本脲和双氯酚酸
• 4.2 吲哚美辛、格列本脲和双氯酚酸的微生物转化条件的考察
• 4.2.1 吲哚美辛和格列本脲转化产物的检测
• 4.2.1.1 吲哚美辛样品预处理
• 4.2.1.2 格列本脲样品预处理
• 4.2.1.3 双氯酚酸样品预处理
• 4.2.1.4 质谱条件均相同
• 4.2.2 转化菌种、最优pH及最佳底物浓度的确立
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 吲哚美辛、格列本脲和双氯酚酸转化产物的检测
• 4.3.1.1 吲哚美辛转化产物的检测
• 4.3.1.2 格列本脲转化产物的检测
• 4.3.1.3 双氯酚酸转化产物的检测
• 4.3.2 最优转化条件的建立结果
• 4.3.3 比较微生物转化产物同人体CYP2C9代谢产物的异同
• 4.3.4 确立最佳模型菌种
• 4.4 讨论
• 第五章 人体CYP2C9化学抑制剂对短刺小克银汉霉AS3.910药物代谢酶的抑制
• 5.1 丙戊酸、磺胺苯吡唑和苯溴马隆
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 转化方法
• 5.2.2 转化样品的检测
• 5.3 结果
• 5.3.1 转化样品的检测结果
• 5.3.2 丙戊酸对甲苯磺丁脲4′-羟化的抑制
• 5.3.3 磺胺苯吡唑对甲苯磺丁脲4′-羟化的抑制
• 5.3.4 苯溴马隆对甲苯磺丁脲4′-羟化的抑制
• 5.4 讨论
• 第六章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历
• 发表论文