Bcl-xL反义寡核苷酸联合嘧啶亚硝脲治疗脑胶质母细胞瘤的实验研究

论文摘要

胶质母细胞瘤的发生发展不仅与肿瘤细胞的克隆性异常增生有关,而且与肿瘤细胞正常凋亡功能的减弱和凋亡抑制基因的过度表达有密切关系,可能存在多种形成和发展通路/途径。尽管各种分子病理学途径不完全相同,但差不多所有的胶质母细胞瘤都具有共同的神经病理学特点和生物行为学特性:潜在的高侵袭性、潜在的性、活跃的增值能力和对常规的细胞毒素药物治疗耐药,是所有人类肿瘤中治疗最困难的一种。亚硝脲类药物是治疗恶性胶质瘤的首选药物,在胶质母细胞瘤术后治疗中具有重要的作用,如何使它在常规安全剂量下,发挥最大疗效是众多学者们都在研究的课题。Bcl-xL基因是bcl-2家族中重要的凋亡抑制基因,在正常组织中低表达,在人类恶性肿瘤组织中广泛表达,它的异常表达可使已有基因异常改变的细胞逃避凋亡,与肿瘤的发生、发展及预后有关,与许多恶性肿瘤的化疗耐药性存在密切关系。.已发现它的表达与多种肿瘤预后相关,目前为止,有关Bcl-xL诱导肿瘤细胞凋亡的研究多集中在消化系统、泌尿系统肿瘤及黑色素瘤方面,而Bcl-xL在胶质母细胞瘤中的表达特点和联合亚硝脲类药物治疗相关研究国内外尚未见报道。本研究从观察不同胶质母细胞瘤组织中Bcl-xL的表达情况入手,分析总结Bcl-xL表达及其表达水平与与患者临床预后的相关性,并采用阳离子脂质体介导的反义寡核苷酸技术进行了体内外实验治疗的系统研究,主要内容及结果如下:第一部分Bcl-xL在胶质母细胞瘤中的表达以及与临床预后的相关性研究目的:分析总结Bcl-xL在胶质母细胞瘤组织中的表达及其表达水平与与患者临床预后的相关性,为胶质母细胞瘤的综合治疗和诱导分化治疗提供临床依据。方法:应用免疫组化和RT-PCR技术系统检测了20例正常脑组织、53例原发胶质母细胞瘤组织、35例复发胶质母瘤组织、16例术前经过放射治疗和11例术前经过化疗的胶质母瘤组织和人工培养的胶质母细胞瘤A-172细胞株中Bcl-xL蛋白和Bcl-xL mRNA的表达。免疫组化和RT-PCR试验是在双盲下进行的,实验操作者事前并不知道该患者的临床资料和随访结果。用单变量分析和多变量分析研究Bcl-xL表达和生存之间的关系,使用Kaplan-Meier法计算生存曲线并采用Logrank（对数秩）检验。结果:胶质母细胞瘤组织及人胶质母细胞瘤A-172细胞株中均存在着Bcl-xL蛋白和Bcl-xL mRNA的过表达,但也存在着Bcl-xL的差异性表达。复发性胶质母细胞组织中Bcl-xL阳性率大于首次接受治疗的胶质母细胞瘤组织,其相对表达量也高于首次接受手术的胶质母细胞瘤组（P＜0.05）。在复发胶质母细胞瘤组中,化疗后手术组Bcl-xLmRNA相对量明显高于放疗后手术组。阳性率差异不显著（P＞0.05）,但阳性强度等级构成比差异显著性（P＜0.05）,其相对表达量化疗后手术组明显高于放疗后手术组,具有显著性差异（P＜0.01）。生存分析显示;88例中,Bcl-xL86.36%（76/88）阳性表达,全组阴性患者生存时间明显高于阳性病例（P＜0.01）,阴性患者平均生存时间23.5个月,阳性病例只有10.8个月。Bcl-xL表达水平和表达强度与患者生存时间缩短有密切负相关系（P＜0.05）。结论:首先,Bcl-xL在胶质母细胞瘤中的过表达,增强了肿瘤细胞亲润性生长的能力。可能是胶质母细胞瘤逃逸凋亡的内在原因之一,也是造成胶质母细胞瘤恶性生长的机制之一。Bcl-xL的阳性表达和表达水平可以作为胶质母细胞瘤预后价值指标。为胶质母细胞瘤分子病理学研究带来的新思路。其次,在体外细胞株试验中,Bcl-xL的表达可以直接引起化疗耐药和对放射治疗的耐受。在临床上也确实存在这种情况,因为本组病例从选择到治疗都是同一标准,但结果并不相同,也可能是Bcl-xL表达降低了这些细胞的凋亡能力。第二部分Bcl-xL反义寡核苷酸联合ACNU体外治疗胶质母细胞瘤的实验研究目的:探讨Bcl-xL反义寡核苷酸联合嘧啶亚硝脲（ACNU）在抑制胶质母细胞瘤细胞增殖以及体外下调Bcl-xLmRNA和蛋白的表达与细胞凋亡的作用。方法:采用阳离子脂质体介导的反义寡核苷酸技术转染胶质母细胞瘤A-172细胞株,并应用RT-PCR、Western blot杂交、MTT检测、流式细胞术和细胞凋亡的原位酶标记检测（TUNEL检测）等技术进行了胶质母细胞瘤体外治疗的相关研究。结果:Bcl-xL-ASODN和ACNU对A-172细胞都具有一定的程度的凋亡诱导作用,ACNU单一治疗最佳浓度为25ug/ml,凋亡率为40.82%（FCM）,Bcl-xL-ASODN最佳浓度为300nmol/L,细胞凋亡率为37.88%（FCM）。Bcl-xL反义寡核苷酸联合ACNU治疗组对肿瘤细胞抑制率为88.63%,对Bcl-xL mRNA表达的抑制率为88.76%,在mRNA和蛋白质水平分别下调了88.76%和87.04%;同时,caspase-3的表达增加了430.41%,肿瘤细胞凋亡率为80.54%,与对照组、空白组、NODN组、ACNU和ASODN组相比较,均具有显著差异（P＜0.05）。结论:阳离子脂质体介导法具有使用方便、特异性封闭靶基因及无毒性等特点,是外源基因导入细胞内的良好途径。Bcl-XL反义寡核苷酸联合嘧啶亚硝脲可有效抑制胶质母细胞瘤的细胞增值,揭示了影响胶质母细胞瘤细胞凋亡的主要机制之一可能是Bcl-xL增强了胶质母细胞瘤恶性增殖能力造成的,通过反义寡核苷酸下调Bcl-xL的表达,显著增强了胶质母细胞瘤对嘧啶亚硝脲的敏感性,提示Bcl-xL高表达是胶质母细胞瘤对嘧啶亚硝脲耐药的又一重要因素,为提高胶质母细胞瘤临床治疗效果提供又一理论依据。第三部分BCL-XL反义寡核苷酸联合ACNU裸鼠体内治疗胶质母细胞瘤的研究目的:探讨Bcl-xL反义寡核苷酸联合嘧啶亚硝脲（ACNU）在抑制移植瘤的生长以及体内下调Bcl-xLmRNA和蛋白的表达与细胞凋亡的作用。方法:首先进行人胶质母细胞瘤细胞株A-172在裸鼠体内的成瘤实验,细胞浓度为1×107/ml,每只鼠右前腿背侧皮下注射0.2ml（细胞数为2×106/ml）,建立人胶质母细胞瘤异种移植瘤实验动物模型。将构建成功的动物模型随机分为5组:空白对照组（A）、无关序列寡核酸对照组（B）、Bcl-xLASODN治疗组（C）、ACNU治疗组（D）、ACNU联合Bcl-xLASODN治疗组（E）;采用瘤旁注射的方式,每日一次共15次。观察裸鼠及移植瘤的生长状态。应用游标卡尺测量、MTT、Western blot、RT-PCR、TUNEL及HE染色等方法,观察裸鼠体内人胶质母细胞瘤移植瘤治疗前后的生长抑制情况及组织学形态,检测移植瘤中Bcl-xL及caspase-3表达变化及移植瘤细胞凋亡的情况。结果:胶质母细胞瘤A-172细胞株裸鼠皮下异种移植成功率为100%,出瘤时间为接种后6-8d。Bcl-xL ASODN在裸鼠体内能够下调移植瘤中Bcl-xL的表达,激活Caspase-3的表达。肿瘤组织中Bcl-xL表达按照C组、D组及E组的顺序表达下调,尤其是E组Bcl-xLmRNA和蛋白质水平的表达分别下调了86.46%和88.31%,均明显高于以上各组（P＜0.01）。E组caspase-3蛋白的表达增加了376.46%,显著高于以上各组（P＜0.01）。TUNEL显示,A、B、C、D、E各组的细胞凋亡率分别为:2.25%、2.75%、36.75%、39.25%、65.25%,C、D、E三组明显高于A、B组（P＜0.01）,且E组又明显高于C、D组（P＜0.01）,经15天的治疗,联合治疗组移植瘤体积缩小了56.36%。结论:单一应用ACNU或Bcl-xLASODN在裸鼠体内对移植瘤生长有一定程度的抑制作用,ACNU联合Bcl-xLASODN在裸鼠体内对移植瘤有明显的治疗作用,降低了肿瘤细胞中Bcl-xL的表达,激活Caspase-3的表达,增加了肿瘤细胞胞对ACNU的敏感性。本研究结果表明,胶质母细胞瘤的发展存在一个渐进过程,细胞凋亡屏障的增加促使部分病人耐药、对放疗不敏感是最终加速复发根本原因,Bcl-xL的异常表达可能是诸多途径中重要的途径之一;Bcl-xL在胶质母细胞瘤中的表达特点,有利于更好理解胶质母细胞瘤的发病机理,为胶质母细胞瘤分子病理学研究带来的新思路,Bcl-xL有可能成为重要的临床预后标记指标。我们采用阳离子脂质体包裹目的基因方法,利用ACNU联合Bcl-xL-ASODN体内外治疗胶质母细胞瘤后,明显抑制了A-172细胞及裸鼠体内移植瘤的生长,下调了肿瘤细胞中Bcl-xL的表达,增加了肿瘤细胞胞对ACNU的敏感性,显著提高嘧啶亚硝脲的治疗效果,表明提高ACNU化疗敏感性与下调Bcl-xL的表达有关,Bcl-xL高表达是胶质母细胞瘤对ACNU耐药的重要因素之一,这为临床克服嘧啶亚硝脲治疗胶质母细胞瘤化疗耐药提供了重要的实验依据,对提高胶质母细胞瘤临床治疗效果具有极大的指导意义。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 Bcl-xL在胶质母细胞瘤中的表达以及与临床预后的相关性研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第二部分 Bcl-xL反义寡核苷酸联合ACNU体外治疗胶质母细胞瘤的实验研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第三部分 BCL-XL反义寡核苷酸联合ACNU裸鼠体内治疗胶质母细胞瘤的研究
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 附录
• 致谢