3-苯氧基苯甲酸降解菌Sphingobium sp. BA3的分离鉴定、生物学特性及基因工程菌的构建

论文摘要

从石油污染土壤中分离到1株能以3-苯氧基苯甲酸（3-PBA）为唯一碳源生长的细菌BA3 （GenBank Accession No.GQ176409）。据其生理生化特征和16S rRNA基因序列序列相似性分析,将该菌鉴定为鞘脂菌属（Sphingobium sp.）。对BA3的生物学特性研究结果显示,该菌株在pH5.0-8.0范围内生长良好,在pH7.0生长最好,最适生长温度为30℃,装液量20mL时,生长量最大,随着装液量的增加生长呈下降趋势。在5-15mg·L-1的盐浓度范围生长较好,以葡萄糖为碳源,以有机氮为氮源的培养基中生长较好,对链霉素有抗性。该菌株在60h内对100mg L-1的3-苯氧基苯甲酸降解率达到99%。降解3-苯氧基苯甲酸的最适温度为30℃,pH值为7.0,降解速率与初始接种量呈正相关。接种量大于3%时有较高降解效果。通过降解菌株BA3利用化合物的情况,发现能利用邻苯二酚、原儿茶酸、对苯二酚、和间苯二酚等,但不能利用苯酚、对硝基苯酚和2,4-二硝基苯酚。根据下载的1,2-双加氧酶基因的保守区设计引物,从3-PBA降解菌株BA3扩增到邻苯二酚1,2-加氧酶基因,得到400bp大小的片段,通过比对发现该序列与Sphingobium sp.YBL3和Sphingobium sp.YBL2的catA基因同源性最高,达到84%。拟除虫菊酯类杀虫剂pytH水解酶基因为研究发现的一个新的菊酯水解酶基因,过PCR从菊酯降解菌株JZ-2总DNA扩增了pytH,将pytH定向克隆到pBBRMCS-5载体上,构建重组质粒pPYTH,在辅助质粒pRK600的帮助下,三亲接合将pPYTH转移到3-PBA降解菌株Sphingobium sp.BA3中,得的工程菌Sphingobium sp.BA3-pytH可以快速降解菊酯类杀虫剂及其中间产物3-PBA; BA3-pytH对菊酯的降解效率较出发菌株JZ-2高。该基因工程菌应比野生菌株JZ-2在菊酯污染环境的生物修中具有优势。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号与缩略语说明
• 前言
• 文献综述
• 1 拟除虫菊酯杀虫剂的应用及其污染
• 2 拟除虫菊酯类农药的微生物降解
• 3 农药降解基因工程菌的研究进展
• 3.1 基因工程菌构建的方法
• 3.2 基因工程菌的构建载体
• 3.3 基因工程菌构建研究中存在的问题
• 3.4 农药降解基因工程菌的生物修复应用
• 4 二苯醚醛键的物质对生态环境和人类健康的的危害
• 5 二苯醚醛键的物质的微生物降解
• 6 3-苯氧基苯甲酸性质及其应用
• 参考文献
• 第一章 3-苯氧基苯甲酸降解菌BA3的分离与鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株、培养基与试剂
• 1.2 降解菌株的富集与分离
• 1.3 降解菌株的培养特征及生理生化鉴定
• 1.4 降解菌株的16S rRNA基因序列的测定
• 1.5 降解菌株系统发育地位的确定
• 1.6 3-PBA含量的测定
• 1.7 菌体生长量的测定
• 2 结果与分析
• 2.1 污染土壤中3-PBA降解菌株的分离
• 2.2 降解菌株BA3的菌落形态及生理生化特征
• 2.3 降解菌株BA3的鉴定结果
• 2.4 境条件对降解菌株BA3生长的影响
• 2.5 降解菌株BA3对抗生素的耐受性
• 3 本章小结
• 参考文献
• 第二章 3-苯氧基苯甲酸降解菌BA3降解特性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 培养基与试剂
• 1.2 菌体生长量的测定
• 1.3 菌株BA3对3-苯氧基苯甲酸农药降解特性研究
• 1.4 底物利用试验
• 1.5 菌株中的catA基因的扩增
• 2 结果与分析
• 2.1 菌株以3-PBA为唯一碳源的生长及降解实验
• 2.2 化合物起始浓度对菌株BA3降解3-PBA的影响
• 2.3 接种量对BA3降解3-PBA的影响
• 2.4 pH值对菌株BA3降解3-PBA的影响
• 2.5 度对BA3降解3-PBA的影响
• 2.6 底物利用谱
• 2.7 catA基因的扩增
• 3 本章小结
• 参考文献
• 第三章 拟除虫菊酯类杀虫剂基因工程菌的构建
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株与质粒
• 1.2 培养基及培养条件
• 1.3 抗生素及使用浓度
• 1.4 试剂和酶
• 1.5 DNA的分子操作
• 1.6 菊酯水解酶基因pytH克隆和广宿主载体的构建
• 1.7 基因工程菌的构建
• 2 结果与分析
• 2.1 pytH基因克隆和表达质粒的构建
• 2.2 工程菌的构建
• 2.3 工程菌BA3-pytH对甲氰菊酯的降解
• 3 本章小结
• 参考文献
• 全文总结
• 本文的创新点
• 附录一 文中所用培养基及试剂配方
• 附录二 相关DNA序列
• 攻读硕士学位期间发表或已接收的学术论文
• 致谢