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双歧和芽孢杆菌属双重FQ-PCR建立及SE感染鸭肠道6种优势菌动力学

2020-12-03阅读(105)

双歧和芽孢杆菌属双重FQ-PCR建立及SE感染鸭肠道6种优势菌动力学

论文摘要

本研究建立了检测双歧杆菌属和芽孢杆菌属的双重实时荧光定量PCR（Multiplexreal time Fluorescence louence Quantitative PCR,Multiplex FQ-PCR）方法,并运用已建立的检测双歧杆菌、芽孢杆菌、肠球菌、大肠杆菌、葡萄球菌和乳酸杆菌属实时荧光定量PCR（FQ-PCR）方法对经SE不同途径感染的鸭肠道（十二指肠、空肠、回肠、盲肠、直肠）内上述六种菌属进行定量研究,获如下结果:1.建立了定量检测双歧杆菌属和芽孢杆菌属的双重实时荧光定量PCR方法,其灵敏度分别达到9 CFU/ml和6 CFU/ml,具有良好特异性,运用该方法对健康雏鸭肠道内双歧杆菌属和芽孢杆菌属进行定量检测,证明其具有较好的实用性。2.FQ-PCR对SE感染雏鸭后其肠道内双歧杆菌、芽孢杆菌、肠球菌、大肠杆菌、葡萄球菌和乳酸杆菌属的定量检测结果及其变化规律如下:（1）SE感染雏鸭后,其肠道内双歧杆菌属含量检测结果呈明显减少趋势。经皮下注射感染后12h-6d,其含量都显著低于健康鸭（P＜0.01）;在滴鼻感染后24h-9d都显著低于健康鸭水平（P＜0.05）;经口服感染后12h-9d,其含量都显著低于健康鸭（P＜0.05）;在滴鼻和口服感染后6-9d,该菌属含量在各个肠段中出现回升,只有口服感染后十二指肠内的增加具有显著性（P＜0.05）,但仍然低于健康鸭。（2）定量结果显示,7-16d雏鸭肠道中芽孢杆菌属定植量都较低。就检测率而言,SE感染后各肠段内芽孢杆菌低于健康鸭,在十二指肠内,健康鸭该菌属的检测率为7/12,经皮下注射感染后检测率低至1/11。在空肠和回肠中,分别在皮下注射感染后4-8h和24h-6d不能正常检测出该菌或者检测的量较低;在十二指肠和盲肠内,健康鸭该菌属的检测率分别为7/12和8/12,经滴鼻感染后检测率分别低至4/12和1/12;在盲肠内,健康鸭该菌属的检测率为8/12,口服感染后检测率低至3/12;在感染后36h,空肠内芽孢杆菌数量显著低于健康鸭（P＜0.01）。（3）SE感染雏鸭后,其十二指肠内肠球菌数量的主要变化趋势表现为增加,尤其在皮下注射感染后4-36h（P＜0.05）,口服感染后12-36h,以及滴鼻感染后4-36h,分别在三种途径感染后的24h（P＜0.01）,12h（P＜0.01）和24h（P＜0.01）达到峰值;但在皮下注射感染后48h（P＜0.05）呈明显的递减趋势,以后逐渐恢复至初始水平;直肠内肠球菌含量变化也以增加趋势为主,在皮下注射感染后的4-48h（P＜0.05）,在滴鼻感染后的8-36h（P＜0.05）,在口服感染后的24-36h（P＜0.05）都显著高于健康鸭水平,随后也缓慢恢复初始水平。其他肠段内肠球菌数量以减少趋势为主。（4）SE感染雏鸭后,其肠道内大肠杆菌属含量检测结果呈明显增加趋势。经皮下注射感染后,回肠和盲肠内该菌在感染后8-48h显著高于健康鸭水平（P＜0.05）;经滴鼻感染后,十二指肠内该菌在4-8h（P＜0.05）和36h（P＜0.05）显著高于健康鸭水平,空肠内该菌数量在4h（P＜0.05）、8h（P＜0.05）、36h（P＜0.05）和72h（P＜0.01）显著增加;经口服感染后空肠内该菌数量在48h（P＜0.05）显著增加,盲肠内该菌数量在感染后8-72h显著高于健康鸭水平（P＜0.05）。（5）SE经滴鼻和皮下注射感染雏鸭后,其肠道内葡萄球菌属含量检测结果呈增加趋势,但口服感染后呈波状趋势。经皮下注射感染后4-8h和24-36h表现为增加趋势,分别在感染后4h（P＜0.05）和24h（P＜0.05）出现两个峰值,但在感染后6d各肠段中数量都低于健康鸭水平;经滴鼻感染后24-72h高于健康鸭水平;经口服感染后十二指肠内该菌数量在24h（P＜0.05）和6d（P＜0.05）出现两个最低值,空肠内该菌数量在8h（P＜0.05）显著增加,6d（P＜0.05）出现最低值;回肠和盲肠内该菌数量在4h降低,8-36h出现显著增长,但在感染后6-9d各肠段中数量都趋于健康鸭水平。（6）SE感染雏鸭后,其回肠和盲肠内乳酸杆菌属以定植量的降低最为显著。经皮下注射感染后,回肠和盲肠内该菌数量在感染后8h-6d显著低于健康鸭水平（P＜0.01）;经滴鼻感染后,回肠和盲肠内该菌数量从感染后24h-9d显著低于健康鸭水平（P＜0.01）;经口服感染后回肠内该菌数量从8h-9d显著低于健康鸭水平（P＜0.01）,盲肠内该菌数量从12h-9d显著低于健康鸭水平（P＜0.05）。

论文目录

  • 本论文的创新性研究工作
  • 中文摘要
  • ABSTRACT
  • 缩略词表
  • 第一部分 文献综述及选题目的和意义
  • 第一章 肠炎沙门氏菌及动物肠道微生物生态系统的研究进展
  • 1 肠炎沙门氏菌的研究进展
  • 1.1 概述
  • 1.2 病原学
  • 1.3 流行病学
  • 1.4 诊断方法
  • 1.5 预防和控制
  • 2 动物肠道微生物生态系统的研究进展
  • 2.1 肠道正常菌群
  • 2.2 肠道正常菌群的生理作用
  • 2.3 病原微生物感染对肠道正常菌群的影响
  • 2.3.1 病原微生物侵入肠道打破肠道正常的微生态平衡
  • 2.3.2 破坏肠道粘膜屏障
  • 2.3.3 肠道菌群的易位
  • 2.3.4 调节肠道菌群失衡的措施
  • 2.4 肠道微生态定量研究方法论
  • 3 论文选题目的和意义
  • 第二部分 实验研究
  • 第二章 双重实时荧光定量PCR方法的建立及初步运用
  • 1 材料
  • 1.1 实验动物
  • 1.2 菌株
  • 1.3 实验仪器及主要试剂
  • 1.4 实验试剂的配制
  • 2 实验方法
  • 2.1 双重荧光定量PCR方法的设计
  • 2.2 双重荧光定量PCR方法的建立
  • 2.2.1 验证两菌引物的合理性和特异性
  • 2.2.2 标准品模板的制备
  • 2.2.3 标准品模板拷贝浓度的测定
  • 2.2.4 双重实时荧光定量PCR反应条件的优化
  • 2.2.5 双重实时荧光定量PCR标准曲线的制作
  • 2.2.6 双重实时荧光定量PCR检测细菌数的敏感性
  • 2.2.7 双重实时荧光定量PCR重复性试验
  • 2.2.8 双重实时荧光定量PCR特异性试验
  • 2.2.9 双重实时荧光定量PCR对鸭肠道内双歧杆菌和芽孢杆菌定量检测
  • 2.3 数据处理
  • 3 结果
  • 3.1 验证双重实时荧光定量PCR引物的合理性和特异性
  • 3.1.1 常规PCR产物及测序结果
  • 3.1.2 SYBR Green I PCR做熔点曲线分析
  • 3.2 双重实时荧光定量PCR条件的优化
  • 3.3 双重实时荧光定量PCR标准曲线的制作
  • 3.4 双重实时荧光定量PCR敏感性测定结果
  • 3.5 双重实时荧光定量PCR重复性试验
  • 3.6 双重实时荧光定量PCR特异性试验
  • 3.7 双重实时荧光定量PCR对鸭肠道内双歧杆菌和芽孢杆菌定量检测结果
  • 4 讨论
  • 5 小结
  • 第三章 人工感染肠炎沙门氏菌对鸭肠道菌6种细菌（双歧杆菌、芽胞杆菌、肠球菌、大肠杆菌、葡萄球菌、乳酸杆菌）数量的影响
  • 1 材料
  • 1.1 实验动物
  • 1.2 菌株
  • 1.3 实验仪器及主要试剂
  • 1.4 实验试剂的配制
  • 2 实验方法
  • 2.1 动物试验
  • 2.1.1 感染剂量设计
  • 2.1.2 实验鸭饲养管理
  • 2.1.3 动物分组和采样时间表
  • 2.2 采样设计
  • 2.3 样品处理及粪便中菌群总DNA的提取
  • 2.4 阳性模板的制备
  • 2.4.1 标准菌株的培养
  • 2.4.2 标准菌株基因组的提取
  • 2.5 样品的检测分析
  • 3 结果
  • 1）检测死亡率结果'>3.1 鸭源SE（MY1）检测死亡率结果
  • 3.1.1 口服组
  • 3.1.2 滴鼻组
  • 3.1.3 皮下组
  • 3.2 FQ-PCR对鸭肠道内双歧杆菌、芽孢杆菌、肠球菌、大肠杆菌、葡萄球菌和乳酸杆菌动力学的研究
  • 3.2.1 对照组鸭肠道内双歧杆菌、芽孢杆菌、肠球菌、大肠杆菌、葡萄球菌和乳酸杆菌数量变化规律
  • 3.2.2 人工感染鸭肠道内双歧杆菌、芽孢杆菌、肠球菌、大肠杆菌、葡萄球菌和乳酸杆菌数量变化规律
  • 4 讨论
  • 4.1 实时荧光定量PCR技术在肠道微生物生态学中的应用及优点
  • 4.2 健康雏鸭肠道内六菌属的检测分析
  • 4.3 SE感染雏鸭后对其肠道内菌群的影响
  • 5 小结
  • 5.1 健康雏鸭肠道内主要菌群变化
  • 5.2 SE感染后对鸭肠道内主要菌群的影响
  • 第三部分 结论
  • 第四部分 参考文献
  • 附表
  • 致谢
  • 攻读学位期间发表的学术论文目录

    • 相关论文文献

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