氯氰菊酯降解菌株CDT3、PBM11的分离、降解特性及协同代谢研究

论文题目: 氯氰菊酯降解菌株CDT3、PBM11的分离、降解特性及协同代谢研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 微生物学

作者: 许育新

导师: 李顺鹏

关键词: 氯氰菊酯,苯氧基苯甲酸,降解菌,降解途径,协同代谢,酯酶

文献来源: 南京农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 拟除虫菊酯类杀虫剂是一类人工合成的，类似天然除虫菊素的化合物。氯氰菊酯是拟除虫菊酯类杀虫剂的一种，虽然氯氰菊酯被认为是高效低毒的农药，但是，氯氰菊酯具有对光、热稳定的特点，在环境中的半衰期较长，很难在自然条件下快速降解，造成了作物和土壤中此类农药的大量残留，给人们的健康带来了巨大的威胁。农药残留降解菌技术具有高效、无毒、无二次污染的特点，而且经济实用，操作简便，目前已成为去除农药残留污染的一种重要方法。从农药厂污泥中分离到一株氯氰菊酯的降解菌，命名为CDT3。经生理生化试验和16SrDNA序列分析，CDT3被鉴定为红球菌属（Rhodococcus sp.）。CDT3在摇瓶中对100mg/L氯氰菊酯72h降解效率达到84.24％。在温度30℃，pH8.0时，CDT3对氯氰菊酯的降解率最高。CDT3可以降解200mg/L的氯氰菊酯，是目前单株菌降解拟除虫菊酯的最高浓度。CDT3不能利用氯氰菊酯生长，以共代谢的方式降解氯氰菊酯。添加少量葡萄糖、蛋白胨、酵母汁均能促进它对氯氰菊酯的降解。小区试验中对茶叶上氯氰菊酯的降解率达到68.94％。研究了CDT3降解氯氰菊酯的代谢途径，通过GC-MS分析，证实氯氰菊酯被CDT3降解后的中间产物是3-苯氧基苯甲酸（3-PBA）和二氯菊酸（DCVA），推测氯氰菊酯是由CDT3产生的酯酶降解的。从农药厂污泥中分离了一株3-苯氧基苯甲酸（3-Phenoxybenzoicacid，3-PBA）降解菌株PBM11。经生理生化试验和16SrDNA测定初步鉴定为假单胞菌属（Pseudomonas sp.）。PBM11可以利用3-PBA生长，氯氰菊酯经CDT3和PBM11的联合降解后，检测不到氯氰菊酯和3-PBA的残留。PBM11在pH7.0，30℃，24h可矿化200mg/L的3-PBA；添加低浓度的营养物质能够促进降解。Cu2+和Co2+等对其降解有抑制作用，而Fe3+有明显的促进作用；通过分析底物利用情况，推测PBM11首先在1，2-双加氧酶的作用下将3-PBA降解为原二茶酸（3，4-二羟基苯甲酸）和苯酚。经过7d的处理，PBM11对土壤中100mg/L3-PBA的降解率为66.25％。从PBM11中检测到一个质粒。研究了CDT3和PBM11协同作用对氯氰菊酯的降解，结果表明50mg／L的3-PBA会明显抑制CDT3的生长，3-PBA会对CDT3降解氯氰菊酯产生反馈抑制，

论文目录:

摘要

ABSTRACT

符号与缩略语说明

前言

文献综述

第一章农药污染和生物修复技术

1. 农药的污染

2. 生物修复技术概况

3. 生物修复技术的分类

3.1 原位生物修复技术

3.2 异位生物修复技术

4. 生物修复技术的影响因素

4.1 污染物的生物可利用性(bioavilibility)

4.2 生物活性(bioactivity)

4.3 环境因素

5. 微生物降解有毒化合物的方式

5.1 氧化作用

5.2 还原作用

5.3 水解作用

5.4 缩合或共轭形式

6. 典型有机化合物的生物降解

6.1 芳香族有机化合物的降解

6.2 拟除虫菊酯类农药的微生物降解

第二章生物修复中的分子生物学

1 未培养微生物(unculturable microorganism，UCM)的研究

2 分子生物学方法

2.1 环境微生物群落DNA的提取

2.2 标记核酸探针杂交技术

2.3 原位荧光杂交技术(fluorescent in situ hybridazation，FISH)

2.4 基于PCR技术的研究方法

2.5 微生物基因组中特异DNA片段的序列分析

2.6 DNA扩增片段电泳检测技术

2.7 宏基因组(metagenome)文库的构建和应用

2.8 生物芯片

2.9 报道基因

2.10 生物修复中的应用

3. 可移动遗传元件(MGEs)和水平基因转移(HGT)

研究报告

第一章氯氰菊酯降解菌株CDT3的分离和降解特性研究

第一节氯氰菊酯降解菌的分离、鉴定

1. 材料与方法

1.1 培养基与试剂

1.2 仪器

1.3 降解菌的分离与鉴定

1.4 CDT3对氰氯菊酯的降解试验

1.5 CDT3最适生长条件研究

1.6 CDT3的抗生素抗性试验

1.7 农药检测方法

2. 结果及讨论

2.1 菌株分离与鉴定

2.2 菌株的系统进化分析

2.3 生长曲线测定

2.4 降解性能的验证

2.5 生长条件的研究

第二节氯氰菊酯降解菌株CDT3的降解特性

1 材料与方法

1.1 菌株

1.2 培养基和试剂

1.3 仪器

1.4 CDT3降解氯氰菊酯的特性研究

1.5 茶叶降解试验

1.6 氯氰菊酯残留检测方法

2 结果与讨论

2.1 降解曲线的测定

2.2 接种量与降解率的关系

2.3 CDT3菌株的共代谢的研究

2.4 最佳降解条件

2.5 CDT3对氯氰菊酯的耐受性实验

2.6 茶叶降解试验结果

第三节 CDT3降解氯氰菊酯的途径

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 氯氰菊酯的降解产物和降解途径分析

2 结果与讨论

2.1 降解产的气相色谱检测

2.2 降解产物的GC-MS分析和降解途径推测

3. 讨论

第二章 3-苯氧基苯甲酸(3-PBA)降解菌株PBM11的分离和降解特性研究

1 材料与方法

1.1 培养基和试剂

1.2 仪器

1.3 菌株的富集与分离

1.4 菌株的鉴定

1.5 PBM11 16S rDNA序列的系统进化分析

1.6 PBM11 对3-PBA的降解试验

1.7 3-PBA的检测方法

1.8 CDT3和PBM11联合作用对氯氰菊酯的降解

1.9 环境因素对降解的影响

1.10 底物利用试验

1.11 PBM11土壤降解试验

1.12 PBM11质粒的提取

2 结果与讨论

2.1 菌种分离与鉴定

2.2 PBM11降解性能验证

2.3 CDT3和PBM11联合作用对氯氰菊酯的降解

2.4 环境因素对3-PBA降解的影响

2.5 底物利用谱和降解途径推测

2.6 土壤污染处理试验

2.7 质粒的提取

3 讨论

第三章 CDT3和PBM11协同作用降解氯氰菊酯研究

第一节 CDT3和PBM11协同降解关系的研究

1 材料与方法

1.1 菌株

1.2 培养基和试剂

1.3 仪器

1.4 农药的提取与检测

2. 结果及讨论

2.1 3-PBA对CDT3的生长的影响

2.2 氯氰菊酯对PBM11的生长的影响

2.3 加入PBA对CDT3降解氯氰菊酯的影响

2.4 CDT3和PBM11降解氯氰菊酯的最适比例

2.5 CDT3和PBM11的接种时间对氯氰菊酯降解与菌株生长的影响

3. 讨论

第二节 CDT3和PBM11协同降解土壤中氯氰菊酯及其中间产物3-PBA的研究

1 材料与方法

1.1 供试土壤

1.2 菌液

1.3 培养基

1.4 试剂和仪器

1.5 土壤中协同降解试验方法

1.6 农药的提取和检测

1.7 土壤中微生物结构的分析

1.8 土壤细菌16SrDNA V3区DGGE分析

2. 结果与分析

2.1 土壤中氯氰菊酯和3-PBA的降解试验

2.2 氯氰菊酯污染和施加降解菌对土壤微生物群落结构的影响

3. 讨论

第四章 CDT3中氯氰菊酯降解酶研究和酯酶基因(cesA)的克隆

第一节 CDT3中降解酶活性研究

1. 材料与方法

1.1 菌种及来源

1.2 试剂与仪器

1.3 实验方法

2. 结果及分析

2.1 降解酶液的提取

2.2 CDT3降解酶的酯酶活性初步分析

2.3 降解酶酶反应体系的建立

2.4 降解酶的定位

2.5 降解酶活性的初步研究

3. 讨论

第二节 CDT3中的酯酶基因(cesA)的克隆和序列分析

1. 材料与方法

1.1 菌株与质粒

1.2 培养基和试剂

1.3 感受态细胞的制备

1.4 酶切体系建立

1.5 试剂盒回收酶切片段

1.6 载体脱磷

1.7 酶连

1.8 转化

1.9 CDT3基因文库的构建

1.10 阳性转化子的筛选

1.11 蛋白质电泳分析

1.12 序列分析方法

2 结果与讨论

2.1 CDT3染色体总DNA的提取及Sau3AI酶切

2.2 染色体文库的建立及文库质量的检验

2.3 阳性克隆的获得

2.4 序列测定

2.5 阳性克隆的ORF分析

2.6 cesA结构基因分析

2.7 cesA序列分析

2.8 cesA酯酶的功能验证

2.9 PRT1转化子的总蛋白分析

3 讨论

全文总结

本论文的创新之处

参考文献

附录Ⅰ 文中所用的试剂及培养基配方

附录Ⅱ 文中核酸序列

攻读博士期间发表及已录用的论文

致谢

发布时间: 2006-10-20

参考文献

[1].农药毒死蜱和氯氰菊酯的遗传毒性研究[D]. 崔永.浙江大学2006
[2].铜对土壤中拟除虫菊酯农药主要环境行为影响及复合污染生态效应研究[D]. 刘军.江苏大学2009

氯氰菊酯降解菌株CDT3、PBM11的分离、降解特性及协同代谢研究

猜你喜欢