番茄Cf-4和Cf-9基因介导的过敏性反应调控及基因沉默技术的研究

论文题目: 番茄Cf-4和Cf-9基因介导的过敏性反应调控及基因沉默技术的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 植物病理学

作者: 王长春

导师: 郑重,蔡新忠

关键词: 番茄,番茄叶霉菌,抗病性,过敏性反应,防卫反应,环境条件,湿度,温度,基因沉默,病毒诱导的基因沉默,烟草脆裂病毒,拟南芥

文献来源: 浙江大学

发表年度: 2005

论文摘要: 基因对基因抗性是植物抗病性的重要表现形式。该抗性由植物抗病基因（resistance gene,R）和互补病原物无毒基因（avirulence gene,Avr）共同决定。R与Avr的互作通常导致过敏性坏死（hypersensitive response,HR）。番茄（Iycopersicon esculentum）与叶霉菌（Cladosporium fulvum）系统是研究基因对基因抗性的模式系统。该系统中多对R/Avr互补基因对,包括Cf-4/Avr4和Cf-9/Avr9,已被克隆。本论文研究内容包括两部分。第一部分,以番茄与叶霉菌系统为研究对象,对Cf-4/Avr4和Cf-9/Avr9介导HR产生的特性进行研究。包括Cf-4和Cf-9启动子活性的比较,以及温度和湿度对Cf-4/Avr4和Cf-9/Avr9介导的HR的影响。第二部分,应用于模式植物番茄和拟南芥（Arabidopsis thaliana）的病毒诱导的基因沉默（virus induced gene silencing,VIGS）操作体系的优化和开发。所获主要结果如下: 1.明确了Cf-4和Cf-9基因启动子转录调节活性的差异。构建了Cf-4和Cf-9基因上游3 kb非编码区序列（简称pCf-4和pCf-9）分别与Cf-9和绿色荧光蛋白（green fluorescence protein,GFP）开放阅读框的嵌合结构pCf4∷Cf-9,pCf9∷Cf-9,pCf4∷GFP和pCf4∷GFP,以及由CaMV 35S启动子驱动的嵌合结构35S∷GFP.通过遗传转化,获取了上述五个结构的转基因烟草。将pCf4∷Cf-9和pCf9∷Cf-9转基因烟草与35S∷Avr9纯合烟草进行杂交,所获F1群体中,约50%携带Cf-9/Avr9基因对。这些Cf-9/Avr9烟草在25℃萌发后迅速产生HR,最终死亡。通过比较发现,pCf4∷Cf-9/Avr9基因型和pCf9∷Cf-9/Avr9基因型烟草表现HR的强度,及其对发育的影响,和对温度的敏感性等方面均有显著差异。在25℃培养时,pCf9∷Cf9/Avr9烟草种子萌发后不脱种皮,子叶很小且不能正常展开,整苗鲜重轻,产生的HR显著强于pCf4∷Cf-9/Avr9烟草.然而在32℃条件下,两者HR产生均受到抑制,两种烟草苗的发育情况以及最终表现HR和死亡的时间均相似。通过对上述5个结构的转基因烟草的RT-PCR分析发现,pCf9∷Cf-9和pCf9∷GFP的转录本积累量高于pCf4∷Cf-9和pCf4∷GFP。以上结果说明,pCf9转录调节活性高于pCf4,而且对高温更敏感。

论文目录:

致谢

图表目录

摘要

Abstract

第一章 文献综述

1 植物基因对基因抗病性信号传导

1.1 植物R基因

1.2 病原物无毒基因(avirulence gene，Avr)产物及其功能

1.2.1 病原物Avr基因的克隆

1.2.2 病原物Avr基因的功能

1.2.2.1 病原物Avr基因具有毒性和无毒双重功能

1.2.2.2 病原物Avr基因具有的生化活性和功能

1.3 植物R基因产物对病原物Avr基因产物的识别

1.3.1 受体—配体模式

1.3.2 “保卫”模式

1.4 植物R基因介导的信号传导

1.4.1 植物R基因下游早期信号传导基因

1.4.2 植物R基因介导活化的防卫反应及其信号传导

1.4.2.1 HR

1.4.2.2 氧化迸发(oxidative burst)

1.4.2.3 NO的积累

1.4.2.4 水杨酸的积累及其下游防卫信号传导因子的活化

1.4.2.5 乙烯和茉莉酸的积累及下游防卫信号传导因子的活化

1.4.2.6 不同防卫反应信号传导途径之间的对话(cross-talk)

2 番茄与叶霉菌互作的分子机理

2.1 C.fulvum Avr基因

2.2 番茄抗叶霉菌基因(Cf)

2.2.1 番茄Cf基因在基因组中的组织及其进化

2.2.2 番茄Cf基因产物结构和功能

2.3 番茄Cf蛋白对C.fulvum Avr蛋白的识别

2.4 Cf／Avr互作下游信号传导和防卫反应的激活

2.5 环境条件对Cf介导的HR和抗病性的影响

3 病毒诱导的基因沉默及其在植物基因功能鉴定中的作用

3.1 病毒诱导的基因沉默现象的发现

3.2 VIGS的作用机制

3.3 VIGS病毒载体的开发

3.4 基因沉默的指示基因

3.5 影响VIGS沉默效率的因子

3.5.1 VIGS载体中插入的目的片段

3.5.2 植物培育条件

3.5.3 寄主生育期

3.5.4 VIGS载体病毒的接种方法

3.6 VIGS在功能基因组学研究中的应用

3.6.1 VIGS作为基因鉴定和功能研究工具的优点

3.6.2 VIGS的缺点及其避免方法

3.6.3 VIGS在植物基因功能研究中的应用

3.7 VIGS今后研究方向

4 参考文献

第二章 番茄抗叶霉病基因Cf-4和Cf-9启动子转录调节性的比较分析

1 前言

2 材料与方法

2.1 转化的受体植物

2.2 菌株与质粒

2.3 培养基与抗生素

2.4 用于植物转化的双元表达载体的构建

2.5 烟草叶盘转化与卡那抗性植株的再生

2.6 烟草基因组DNA的提取

2.7 RT-PCR

2.8 转基因烟草的鉴定

2.8.1 PCR检测

2.8.2 抗生素抗性检测

2.8.3 HR检测

3 结果

3.1 Cf-4和Cf-9基因开读框上游非编码区3Kb序列的比较

3.2 Cf-4和Cf-9基因启动子分别与Cf-9和GFP开读框的嵌合表达载体构建

3.3 转基因烟草植株的获取

3.4 Cf-4和Cf-9启动子对Cf-9和GFP基因转录本积累水平的调节活性比较

3.5 不同启动子驱动的GFP基因转化植株的荧光强度检测

3.6 pCfg∷Cf-9／Avr9与pCf4∷Cf-9／Avr9烟草产生的HR比较

3.7 pCf9∷Cf-9／Avr9与pCf4∷Cf-9／Avr9烟草小苗生物重量的比较

3.8 高温条件下，pCf9∷Cf-9／Avr9与pCf4∷Cf-9／Avr9烟草的HR比较

4 讨论

4.1 导致Cf-4启动子与Cf-9启动子转录调控活性及高温敏感性差异的可能原因

4.2 Cf-4／Avr4和Cf-9／Avr9植株小苗产生不同HR的可能原因

4.3 GFP转基因烟草植株的荧光检测

5 参考文献

第三章 高温高湿协同抑制Cf-4／Avr4和Cf-9／Avr9介导的HR

1 前言

2 材料与方法

2.1 植物材料和培育条件

2.2 过敏性细胞死亡的显微检测

2.3 Northern分析

2.4 反Northern分析

3 结果与分析

3.1 高湿条件下Cf-4／Avr4和Cf-9／Avr9番茄苗过敏性坏死延迟产生，强度减弱

3.2 Cf-4／Avr4和Cf-9／Avr9番茄苗子叶HR产生的显微分析

3.3 高温和高湿对Cf-4／Avr4和Cf-9／Avr9番茄苗HR的协同抑制作用

3.4 高湿抑制Cf／Avr苗中与HR，信号传导和防卫反应相关基因的表达

3.5 高湿改变Cf／Avr苗中与HR，信号传导和防卫相关的60个基因的转录本分布型

4 讨论

4.1 一个通用的研究环境条件对R／Avr介导的抗病性的影响的HR产生系统

4.2 高湿抑制Cf／Avr介导的HR的机理

5 参考文献

第四章 TRV介导的拟南芥基因沉默操作方法的优化

1 前言

2 材料与方法

2.1 载体构建

2.2 农杆菌接种液的准备

2.3 农杆菌接种

2.4 植物培养条件

2.5 统计分析

3 结果和分析

3.1 农杆菌接种方法对TRV介导的基因沉默效率的影响

3.2 农杆菌菌液浓度对拟南芥基因沉默效率的影响

3.3 农杆菌菌液恢复培养时间对拟南芥基因沉默效率的影响

3.4 农杆菌接种后拟南芥培养温度对基因沉默效率的影响

3.5 接种时拟南芥不同生育期对基因沉默效率的影响

3.6 结论

4 讨论

5 参考文献

第五章 DNAmβ介导的基因沉默体系可以使番茄成株和花萼基因获得有效沉默

1.前言

2.材料与方法

2.1.基因沉默载体

2.2.农杆菌的准备与接种

2.3.植物培养条件

3.结果与分析

3.1.接种后培养温度对DNAmβ介导的基因沉默效率的影响

3.2.不同生育期番茄植株基因沉默效率的比较

3.3.不同生育期番茄植株基因沉默特性的比较

4.讨论

5 参考文献

第六章 胚根接种：一种新的快速有效的基因沉默方法

1 前言

2 材料与方法

2.1 载体构建

2.2 种子催芽

2.3 农杆菌准备与接种

2.4 植物培育条件

2.5 统计分析

3 结果和分析

3.1 胚根处理法——带胚根种子与农杆菌共培养在本氏烟极小苗中成功获得基因沉默

3.2 带胚根种子处理法基因沉默体系的优化

3.3 带胚根种子处理法成功沉默其它茄科植物内源PDS基因

4 讨论

5 参考文献

攻读博士学位期间发表的论文

发布时间: 2005-07-22

参考文献

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