百合杂交育种、遗传转化及胚性愈伤的初步研究

论文摘要

百合是多年生球根花卉,属于单子叶植物,具有较高的经济价值和观赏价值,现已成为世界上最重要的鲜切花之一。但是百合的种球容易退化,花粉污染花瓣,病害、虫害等问题严重制约着百合的生产和市场需求,因此,采用各种有效的手段培育出抗性强、无花粉、不退化的百合新品种已成为当务之急。本研究从百合的杂交育种、遗传转化两个方面对百合新品种的创制进行了初步的探索,结果如下:（1）杂交育种杂交组合麝香百合（♀）×线叶百合（♂）与晶体百合（♀）×麝香百合（♂）的杂交子房在自然条件下得不到成熟的种子。采用胚抢救的方法,分别授粉后10天、25天进行胚珠培养（以B5、1/2B5为基本培养基）获得了杂交苗;其中杂交组合麝香百合（♀）×兰州百合（♂）授粉10天后采用胚珠培养的方法得到了1.17%的抢救成功率;而杂交组合晶体百合（♀）×麝香百合（♂）授粉25天后进行胚珠培养得到了1.00%抢救成功率。整个实验过程中观察到了胚珠体外的畸形与正常发育情况,并且对杂交苗进行了ISSR分子鉴定。（2）遗传转化再生体系建立起了索邦、西伯利亚、麝香百合、元帅四个百合品种的小鳞片、叶片、叶柄的再生体系,其中再生率小鳞片可以达到95%以上,叶柄达到90%以上,叶片达到80%以上。转化体系以麝香百合、索邦、西伯利亚三个品种的叶片、叶柄、小鳞片作为材料,从基本培养基、浸染时间,共培养时间、菌株选择、菌液浓度、乙酰丁香酮（AS）、外源激素、外植体表面损伤等方面进行了转化体系的探索。结果表明:以索邦的叶片和叶柄作为浸染材料,以没有硝态氮的MS培养基为基本培养基,以农杆菌C58作为转化菌株,表面刻伤后浸染20分钟,共培养4天后进行选择培养效果比较好,得到了较好的GUS的瞬间表达,并且的得到了一定数量的抗性苗。（3）胚性愈伤状态的调整与再生麝香百合假鳞茎的横切薄片诱导出的胚性愈伤组织,从氯化钴、ABA、蔗糖浓度以及光照条件四个方面对胚性愈伤组织的状态进行调整,结果表明:0.05μM/L的氯化钴有利于提高体细胞胚的比例和颗粒性,0.02μM/L和0.01μM/L的氯化钴有利于愈伤体积增大和增殖系数提高;ABA随着其浓度提高,对胚性愈伤的长势、干湿程度、增殖体积和增殖系数的抑制效果越明显,但对胚性愈伤比例和颗粒性的抑制效果不显著;光培养条件下,90g/L和60g/L蔗糖对麝香百合胚性愈伤的比例和颗粒性都有较好的影响,但在暗培养条件下,仅仅60g/L蔗糖的效果较好;光培养和暗培养对胚性愈伤的干湿程度和颗粒性都没有显著的影响。综合结果,麝香百合胚性愈伤的最佳增殖方式为:采用光培养,培养基为:MS+NAA（5.4μM/L）+TDZ（0.4μM/L）+CoC12（0.05μM/L）+蔗糖（60g/L）。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 第一部分 文献综述
• 1 百合的资源分布
• 2 百合杂交育种研究概述
• 2.1 百合杂交育种研究现状
• 2.2 百合杂交育种的意义
• 2.3 百合杂交技术的研究
• 2.3.1 百合的杂交技术
• 2.3.2 百合杂交的不亲和性及其克服途径
• 2.3.3 杂交亲本选配的研究
• 2.4 百合杂交后代培养技术的研究
• 2.4.1 胚培养技术
• 2.4.2 子房培养技术
• 2.4.3 胚珠培养技术
• 2.4.4 心皮培养技术
• 3 百合遗传转化的研究概述
• 3.1 再生体系的研究概述
• 3.1.1 再生体系的建立途径的研究
• 3.1.2 外植体选择上的研究
• 3.1.3 培养基和激素配方上的研究
• 3.2 体细胞胚的研究
• 3.2.1 体细胞胚的研究现状
• 3.2.2 体细胞胚的研究意义
• 3.3 转化体系的研究
• 3.3.1 农杆菌介导法的研究
• 3.3.2 电激法的研究
• 3.3.3 基因枪法的研究
• 4 百合育种的目标
• 5 百合育种工作的发展方向
• 第二部分 利用胚抢救技术对百合杂交育种的研究
• 1. 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 试验环境条件
• 1.3 杂交试验的技术路线
• 1.4 试验药品
• 1.5 实验方法
• 1.5.1 亲本品种群主要特征和品质调查
• 1.5.2 花粉生活力的测定
• 1.5.3 不同杂交组合确定
• 1.5.4 杂交试验的方法
• 1.5.5 适宜培养基的筛选
• 1.5.6 杂交后代的培养观察
• 1.5.7 杂交苗的分子鉴定
• 2. 结果与分析
• 2.1 不同品种杂交亲和性的比较
• 2.2 不同品种花粉萌发力的比较
• 2.3 三种外植体体外培养的生长状况
• 2.4 胚珠体外发育的切片观察
• 2.5 杂交苗的获得
• 2.6 杂交苗的分子鉴定
• 3 讨论
• 3.1 杂交亲本的选择与选配
• 3.2 杂交亲和性的判断
• 3.3 杂交不亲和性的克服
• 3.4 胚珠的体外发育情况
• 3.5 胚抢救培养基的选择
• 3.6 培养基渗透压的控制
• 3.7 胚抢救时间的控制
• 3.8 杂交苗的获得
• 第三部分 遗传转化
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 根癌农杆菌菌株及质粒
• 1.2 试验药品
• 1.3 实验技术路线
• 1.4 培养条件
• 1.5 百合无菌苗的建立
• 1.6 再生体系的建立
• 1.7 根癌农杆菌的培养
• 1.7.1 菌株的活化
• 1.7.2 菌株的保存
• 1.8 卡那霉素对愈伤组织的抗性筛选
• 1.9 转化方法
• 1.9.1 农杆菌的培养和活化
• 1.9.2 转化受体的选择
• 1.9.3 侵染
• 1.10 转化条件的研究
• 1.10.1 硝酸铵对转化率的影响
• 1.10.2 侵染液对转化的影响
• 1.10.3 浸染时间对转化的影响
• 1.10.4 共培养时间对转化率的影响
• 1.11 生根实验并移栽
• 2. 结果与分析
• 2.1 再生体系的建立
• 2.1.1 不同外植体在四种培养基上的再生情况
• 2.1.2 NAA对索邦叶片再生的影响
• 2.1.3 不同外植体再生体系的确定
• 2.2 卡那霉素外植体的抗性筛选
• 2.3 选择培养基培养基的确定
• 2.4 转化条件的研究结果
• 2.4.1 硝酸铵对转化率的影响
• 2.4.2 共培养时间对转化率的影响
• 2.4.3 浸染时间对转化率的影响
• 2.5 GUS染色的瞬间表达
• 2.6 最佳遗传转化体系的获得
• 3 讨论
• 3.1 高频再生体系的建立
• 3.2 抗生素选择压的筛选
• 3.3 影响转化率的因素
• 3.4 百合转基因工程的前景
• 第四部分 麝香百合胚性愈伤组织的诱导及植株再生
• 1. 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 胚性愈伤组织的诱导与增殖
• 1.2.2 胚性愈伤的调整方案
• 1.2.3 胚性愈伤观测指标的制定
• 1.2.4 胚性愈伤的再生试验
• 2 结果与分析
• 2.1 氯化钴对体胚状态的影响
• 2.2 ABA对胚性愈伤状态的影响
• 2.3 蔗糖浓度与光照条件对体胚性状的影响
• 2.4 光照条件对胚性愈伤状态的影响
• 2.5 麝香百合胚性愈伤培养基的确定
• 3. 讨论
• 3.1 氯化钴对体胚状态的影响
• 3.2 ABA对胚性愈伤状态的影响
• 3.3 蔗糖浓度对体胚性状的影响
• 3.4 光照条件对胚性愈伤状态的影响
• 参考文献
• 致谢