连作烟田烟草青枯病的生态控制技术及其微生态机制

论文摘要

烟草青枯病（Tobacco bacterial wilt）是由茄劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum E.F.Smith）引起的一种严重危害世界烟草生产的毁灭性细菌病害,特别是对连作烟草的危害尤为严重。由于目前缺乏高抗青枯病品种以及效果显著的药物,对青枯病的防治主要依靠农业防治和综合防治等农艺措施。本研究通过田间小区试验,探索了作物秸秆及黑麦草等不同覆盖模式、增施钙肥、根域活化技术对连作烟草青枯病的防治作用,同时分析这些生态措施对土壤青枯菌、土壤可培养细菌、真菌种类及数量的影响,并且应用PCR-DGGE技术对土壤细菌的多样性进行分析,为今后探索连作烟田土壤健康的修复技术及其土传病害防治新技术奠定基础。主要的研究结果如下:1. 2009年的田间小区试验结果显示,不论是前膜后草还是前膜后秸的覆盖模式,均能够显著控制连作烟田烟草青枯病的发生,前期和后期的防病效果均能够达到50%左右,十分显著的高于裸栽+秸秆覆盖处理（防治效果仅有14%-25%）;在增施钙肥的试验中,裸栽+增施钙肥处理具有显著的防病作用,全生育期防效在53%以上,高于其它处理,且极显著地高于对照。而地膜覆盖+增施钙肥处理的防病效果最高,达74%。在根域活化措施试验中,4月底裸栽+移栽时用保根剂处理的防病效果比较明显。2.采用常规的分离培养法分别分析了2009年、2010年连作烟田土壤中的青枯菌、细菌及真菌数量。两年的分析结果表明,地膜覆盖+种植黑麦草、增施钙肥以及某些根域活化措施,对土壤青枯菌的繁衍有明显的抑制作用,同时,对土壤细菌和真菌数量的富集作用明显。3.为了分析土壤微生物的多样性,对PCR-DGGE检测体系进行的优化研究表明,在进行巢氏PCR的第二轮时,细菌通用引物对BacGC-P3/P2的退火温度最适为57℃;第二轮PCR反应以降落PCR的效果更好。DGGE电泳的最优变性梯度范围为40%-80%,最优化的电泳时间为6h。4.运用优化的PCR-DGGE检测体系分析了2010年田间试验38个土样的细菌多样性,结果显示,盖膜+种植黑麦草处理及盖膜+增施钙肥处理在烟草全生育期均具有显著富集土壤细菌的作用;增施钙肥+秸秆覆盖处理、移栽时的根域活化处理（成分I:1g/穴+成分II:3g/穴）在烟草生长中后期具有富集土壤细菌的作用;盖膜+秸秆覆盖处理、移栽时的根域活化处理（成分I:0.2g/穴+成分II:8g/穴）仅在烟株的生长末期具有显著的富集细菌的作用。这一分子生态学结果与田间防治效果基本吻合。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 1. 文献综述
• 1.1 烟草青枯病研究概况
• 1.1.1 烟草青枯病的发生、分布与危害
• 1.1.2 病原菌基本特性
• 1.1.3 病原菌的寄主范围及所致烟草症状
• 1.1.4 烟草青枯病的流行规律
• 1.1.5 烟草青枯病的致病机制
• 1.1.6 烟草青枯病的防治现状
• 1.1.6.1 抗病育种
• 1.1.6.2 栽培措施防治
• 1.1.6.3 化学防治
• 1.1.6.4 生物防治
• 1.2 土壤健康与土传病害关系的研究现状
• 1.2.1 土壤健康的研究概况
• 1.2.2 土壤中的微生物与土壤健康指标
• 1.2.3 土壤微生物的多样性在土壤抑病中的作用研究
• 1.2.4 土壤微生物多样性的分析技术研究现状
• 1.3 PCR-DGGE 在土壤健康微生态机制研究中的应用
• 1.3.1 PCR-DGGE 技术的原理
• 1.3.2 PCR-DGGE 技术的研究进展
• 2. 引言
• 3. 材料与方法
• 3.1 材料
• 3.1.1 试验所需主要试剂
• 3.1.2 试验所需主要培养基
• 3.1.3 试验所需主要仪器
• 3.1.4 土样信息
• 3.2 方法
• 3.2.1 连作烟田青枯病的生态控制技术田间试验设计
• 3.2.1.1 不同覆盖模式改良土壤及微生态修复防病小区试验
• 3.2.1.2 根域活化处理防治连作烟田青枯病小区试验
• 3.2.1.3 增施钙肥防治烟草青枯病试验
• 3.2.2 土壤样品的采集
• 3.2.3 供试土样的分离与培养
• 3.2.3.1 供试土样中烟草青枯菌的分离培养与PCR 验证
• 3.2.3.2 供试土样中土壤微生物的分离与培养
• 3.2.3.3 供试土样中土壤真菌的分离与培养
• 3.3 连作烟田土壤细菌多样性的PCR-DGGE 检测
• 3.3.1 土壤细菌多样性的PCR-DGGE 技术体系构建
• 3.3.2 利用优化的PCR-DGGE 体系分析连作烟田土壤细菌的多样性
• 4. 结果分析
• 4.1 连作烟田青枯病的生态控制技术田间试验结果分析
• 4.1.1 不同的生态控制技术对烟草青枯病的控制作用
• 4.1.2 不同生态控制技术对青枯菌数量动态的影响
• 4.1.3 应用土壤青枯菌的PCR 检测技术对传统分离培养的验证
• 4.2 不同生态控制技术对微生物种群的影响
• 4.3 PCR-DGGE 在土壤细菌多样性检测中的应用研究
• 4.3.1 土壤细菌多样性的PCR-DGGE 技术体系优化结果
• 4.3.1.1 PCR 反应条件优化结果
• 4.3.1.2 DGGE 变性剂梯度范围优化结果
• 4.3.1.3 DGGE 电泳时间长度的优化结果
• 4.3.2 利用优化的PCR-DGGE 体系分析连作烟田土壤细菌多样性检测结果
• 4.3.2.1 土壤中微生物总DNA 第一轮PCR 扩增结果
• 4.3.2.2 土壤中微生物总DNA 第二轮PCR 扩增结果
• 4.3.2.3 土壤中微生物巢氏PCR 结果DGGE 检测
• 5. 结论与讨论
• 5.1 结论
• 5.2 讨论
• 5.2.1 常规分析的实用性
• 5.2.2 PCR 检测体系半定量检测的实用性
• 5.2.3 PCR-DGGE 技术的实用性
• 5.2.4 田间处理防病效果的评价
• 参考文献
• ABSTRACT