枯草芽孢杆菌Czk1发酵工艺的优化及其对橡胶树炭疽病、根病生防效果初步研究

论文摘要

随着人们环保意识的加强,社会对化学药剂污染环境、产生农药残留等问题的日益关注。生物防治是一项可持续的植保技术,可以克服化学农药的缺点,是目前植保领域的热门研究课题。本研究以橡胶树内生菌细菌Czk1为试材,研究其发酵条件和工艺,评价其对橡胶树根病和炭疽病的生防效果,目的是为Czk1在橡胶树病害生物防治的开发利用奠定基础。主要研究结果如下：[1]利用形态学和分子生物学手段,将内生菌细菌Czk1菌株鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）。[2]研究了Czk1菌株的培养基配方,获得最适合Czk1生长的培养基配方：2%的葡萄糖、1%的酵母浸粉+胰蛋白胨-氯化铵（2：2：1）、0.3%磷酸氢二钠+0.1%的磷酸二氢钠,碳氮比为2：1。[3]研究了Czk1的培养条件,获得最适合Czk1生长的培养参数：培养温度为33。C,初始pH值为7.5,转速为200r/min,培养时间为24h,初始接种量为5%,通气量为100ml。[4]评价了Czk1对橡胶树根病和炭疽病菌的抑菌效果,发现Czk1对14种参试的橡胶树病原真菌具有强烈的抑菌作用,抑菌带宽度达到0.6～1.6cm,并且可导致病原菌菌落和菌丝形态畸形。[5]离体叶片和盆钵苗上评价了Czk1对橡胶炭疽菌的生防效果,发现Czk1能显著降低橡胶炭疽菌的发病率和严重度。[6]测定了Czk1对病原真菌抑菌效果的稳定性,发现Czk1继代培养20次仍能保持原有的抑菌效果,表明Czk1的抑菌特性不容易因长期离体保存而丧失。[7]研究了Czk1对抗生素的敏感性,发现Czk1对四环素、红霉素、氨苄青霉素、利福平、链霉素、卡那霉素均高度敏感。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 1 前言
• 1.1 枯草芽孢杆菌及其在农业上的应用
• 1.1.1 枯草芽孢杆菌
• 1.1.2 枯草芽孢杆菌对植物的促生作用及其机制
• 1.1.3 枯草芽孢杆菌的植病生防作用及其机制
• 1.1.3.1 竞争作用
• 1.1.3.2 拮抗作用
• 1.1.3.3 诱导抗性
• 1.1.4 枯草芽孢杆菌在农业上的开发利用
• 1.2 微生物的发酵工艺的概述
• 1.2.1 发酵工艺及方法
• 1.2.1.1 固体发酵法
• 1.2.1.2 液体发酵法
• 1.2.2 菌种的选育
• 1.2.3 培养基的组成与制备
• 1.2.3.1 培养基的类型
• 1.2.3.2 培养基的配制原则
• 1.2.3.3 培养基的成分
• 1.2.3.4 最佳培养基的确定
• 1.2.3.5 培养基的灭菌
• 1.2.4 空气除菌
• 1.2.5 发酵工艺的控制
• 1.2.5.1 温度对发酵的影响及控制
• 1.2.5.2 pH对发酵的影响及控制
• 1.2.5.3 溶氧量对发酵的影响及控制
• 1.2.5.4 二氧化碳对发酵的影响及控制
• 1.2.5.5 发酵过程中间补料过程的控制
• 1.2.5.6 泡沫对发酵的影响及控制
• 1.2.5.7 发酵终点的判断
• 1.2.5.8 发酵过程计算机控制
• 1.3 橡胶树根病、炭疽病的分布和危害情况
• 1.3.1 橡胶树根病的危害及防治技术上存在的问题
• 1.3.2 橡胶炭疽病的危害及防治技术上存在的问题
• 1.4 本研究的内容与意义
• 1.5 本研究的技术路线
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 供试菌株
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 病原菌
• 2.1.4 抗生素
• 2.1.5 种子
• 2.1.6 叶片
• 2.1.7 实验器材
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 枯草芽孢杆菌Czkl的鉴定
• 2.2.1.1 形态特性与生理生化反应
• 2.2.1.1.1 革兰氏染色
• 2.2.1.1.2 甲基红
• 2.2.1.1.3 V-P测定
• 2.2.1.1.4 致死温度的测定
• 2.2.1.2 内生菌的分子鉴定
• 2.2.1.2.1 细菌菌液的制备
• 2.2.1.2.2 引物设计及PCR反应
• 2.2.1.2.3 PCR产物的回收
• 2.2.1.2.4 Vector与PCR产物的连接
• 2.2.1.2.5 连接产物的转化及测序
• 2.2.2 枯草芽孢杆菌Czk1生长曲线的绘制
• 2.2.3 菌种活化及菌液制备
• 2.2.4 摇瓶发酵培养
• 2.2.5 培养基的优化实验
• 2.2.5.1 单因子实验
• 2.2.5.2 各单因子的不同浓度的实验
• 2.2.5.3 培养基组分分配比优化
• 2.2.6 发酵条件的优化
• 2.2.7 测定方法
• 2.2.8 枯草芽孢杆菌Czk1对橡胶树根病和炭疽病的抑菌效果评价
• 2.2.8.1 枯草芽孢杆菌Czk1的制备
• 2.2.8.2 病原菌的制备
• 2.2.8.3 枯草芽孢杆菌Czkl菌悬液的制备
• 2.2.8.4 测定的方法
• 2.2.9 抗生素标记
• 2.2.9.1 纸片法
• 2.2.9.2 平板法
• 2.2.10 枯草芽孢杆菌Czk1对橡胶树炭疽病菌离体叶片的拮抗效果
• 2.2.11 枯草芽孢杆菌Czk1对橡胶树炭疽病菌盆钵橡胶苗的拮抗效果
• 3 结果与分析
• 3.1 枯草芽孢杆菌Czk1的鉴定
• 3.1.1 枯草芽孢杆菌Czk1形态观察与生理生化反应
• 3.1.1.1 形态特性
• 3.1.1.2 MR测定和V-P测定
• 3.1.1.3 致死温度
• 3.1.2 枯草芽孢杆菌Czk1分子鉴定结果与分析
• 3.1.2.1 PCR产物电泳及回收
• 3.1.2.2 转化子的菌落PCR检测
• 3.1.2.3 序列分析
• 3.2 枯草芽孢杆菌Czk1生长曲线的绘制
• 3.3 发酵培养基优化结果与分析
• 3.3.1 培养基中不同碳源、氮源和无机盐的单因子实验
• 3.3.1.1 碳源
• 3.3.1.2 氮源
• 3.3.1.3 无机盐
• 3.3.2 发酵培养基中最佳碳源、氮源和无机盐不同浓度的影响
• 3.3.2.1 葡萄糖浓度对Czk1菌株生长的影响
• 3.3.2.2 复合氮源浓度对Czk1菌株生长的影响
• 3.3.2.3 复合无机盐浓度对Czk1菌株生长的影响
• 3.3.3 发酵培养基中碳源、氮源和无机盐的优化
• 3.4 发酵条件的优化结果与分析
• 3.4.1 菌体生长的最佳温度
• 3.4.2 菌体生长的最短初始pH值
• 3.4.3 菌体生长的最佳通气量
• 3.4.4 菌体生长的最佳转速
• 3.4.5 菌体生长的最佳培养时间
• 3.4.6 菌体生长的最佳初始接种量
• 3.5 枯草芽孢杆菌Czk1对橡胶树根病和炭疽病菌的抑菌效果评价
• 3.6 Czkl对抗生素的敏感性测定结果
• 3.7 枯草芽孢杆菌Czk1对橡胶树炭疽病离体叶片的生防效果
• 3.8 枯草芽孢杆菌Czk1对橡胶炭疽病橡胶树盆钵苗生防效果的初步评价
• 4 讨论
• 4.1 枯草芽孢杆菌Czk1的鉴定
• 4.2 枯草芽孢杆菌Czk1生长曲线的绘制
• 4.3 枯草芽孢杆菌Czk1培养条件及发酵培养基的优化
• 4.4 枯草芽孢杆菌Czk1对橡胶树根病和炭疽病菌的抑菌效果评价
• 4.5 枯草芽孢杆菌Czk1对抗生素的敏感性
• 4.6 枯草芽孢杆菌Czk1对橡胶树炭疽病菌的生防效果评价
• 5 结论与研究展望
• 5.1 结论
• 5.2 研究展望
• 项目资助
• 参考文献
• 发表相关论文
• 致谢