细鳞鱼稚鱼消化酶组织化学、营养需求与高脂饲料对生理机能影响的研究

论文摘要

本课题通过细鳞鱼稚鱼消化道组织学与消化酶组织化学试验、营养需求饲养试验并结合消化酶调节与抗氧化酶防御的生理反应试验,研究了投喂人工饲料稚鱼胃肠组织结构与消化酶分布、蛋白质与脂类需求、高脂饲料对消化酶分泌调节与肠道发育以及抗氧化酶防御生理反应的影响与作用机理。共分5个试验,分述如下:试验1,以孵化后40d、投喂生物饵料的细鳞鱼稚鱼为试验对象,以组织学和组织化学方法,观察细鳞鱼肠道形态发育与水解酶分布情况。组织学观察结果表明,肠道已经形成了较为完整的绒毛结构,具备了消化食物的结构特征。肠道前端肌层较薄,而绒毛较长,能够在肠腔中充分延伸,保证了绒毛与食糜间的充分接触,具备了提高消化吸收效率的组织结构。后段肌层加厚,可能与食糜运动增加、形成并排泄粪便有关。组织化学鉴定结果显示,肠道已经有水解酶类,碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、非特异性酯酶、酯酶和磷脂酶A2的分布。肠段前部为酶类分布的主要区域,说明肠道前段对营养物质的消化起到了关键性作用,而后段消化能力较弱。酸性磷酸酶活性的存在说明细胞内消化也是稚鱼阶段消化的重要组成。试验2,采取孵化后的60d样本,每组80尾,体重为350±50mg/尾。采用Mg2+沉淀法进行匀浆沉淀,分别用28,000g和43,000g两种离心速度构成两个处理。以碱性磷酸酶、γ-谷氨酰转移酶代表刷状缘膜酶,Na+-K+-ATP酶代表基底侧膜,琥珀酸脱氢酶代表线粒体,经离心处理与原始匀浆酶活性比对,评价BBMV制作效果。结果表明,以Mg2+为沉淀剂的前提下,采用43000g的二次离心要好于28000g。43000g不仅可以完全移去基底侧膜,而且能够很好的控制细胞器的污染;而28000g离心沉淀中有一定程度的细胞器污染,BBM水解酶的富集程度也要低于43000g。本试验证明43000g制作的BBMV可以较好的对刷状缘膜水解酶进行富积纯化,适合于评价细鳞鱼稚鱼消化道水解酶发育以及活性水平的研究。试验3,以40%、48、55%为三个蛋白质梯度,15%、20%、25%、30%四个脂类梯度饲料分别孵化后投喂25d的稚鱼,经36d的养殖后,分别对生长、体长与成活率进行统计,得出阶段与终结果。结果表明在所有处理中,以蛋白48%、脂肪25%处理和蛋白55%、脂肪25%处理养殖稚鱼的上述指标最高。对照组的成活率为80%,而蛋白质含量40%的所有处理的成活率均低于70%,低于蛋白48%与55%所有处理（蛋白48%、脂肪30的除外）,可以推断饲料的蛋白含量影响到鱼类的正常生长。体长结果显示,除P40处理的体长较小外,P48和P55的体长近似,以高脂肪水平体长增加较明显,说明高脂水平不仅提高了营养物质吸收,而且还促进了骨骼的形成。试验4,以蛋白质含量为48%,脂类含量为15、20、25、30%饲料投喂的稚鱼为研究对象,分别测定胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶以及肠道BBM上的碱性磷酸酶、γ谷氨酰胺转移酶活性变化,研究饲料对胰腺消化酶和肠道刷转缘膜酶活性的影响,进而评价饲料在调节胰腺分泌和消化道成熟方面的影响。结果表明:（1）脂类水平高于15%的饲料,刷状缘上酶活性有明显提高。而适宜的脂类水平（25%）,肠道γ-GT和AKP都有显著升高,可能起到了促进消化道成熟的作用,并且说明刷状缘膜的水解酶活性有了较高的表达。（2）在试验后期,L2、L3和L4的脂肪酶活性出现了平台,说明胰腺分泌以及脂类水解能力已经接近于饱和水平。（3）胰蛋白酶活性虽然受到了脂类水平影响,但各处理间并没有表现出明显的规律性。初期,对照与L1的酶活水平呈逐渐降低的趋势,且与食物的相关度较高(rcon2=0.9146,r12=0.9138),但后期L1酶活性升高,可能是分泌增强的结果。L3酶活性始终处于较高水平,说明饲料脂类水平可能刺激了蛋白酶的分泌,与脂肪酶起到了消化食物的协同作用。而在前期L4酶活水平处于抑制状态,后期逐渐升高,说明脂类水平的升高虽然刺激了脂肪酶的分泌,但可能打破了酶类合成与分泌的平衡,表现为脂肪酶分泌加强,而蛋白酶抑制,后期酶活性的升高可能与合成能力的提高有一定的关系。（4）淀粉酶活性受到了饲料淀粉水平的影响。这种情况与鱼类利用碳水化物的能力有关,淀粉酶活性的变化没有脂肪酶变化的明显,但在L2和L3处理中,酶活性有一定的升高,可能与脂类水平有关。适量的脂类水平可以促进至于对碳水化合物的利用,但过高就可能产生抑制作用。（5）本试验中投喂人工饲料可以产生良好的增重效果。终体重最低的是L1处理。饲料脂类含量由15升高到30%,终体重最大可以相差15%以上。同样,饲料脂类水平也影响到了成活率。过低或过高的脂类成活率均较低。成活率最高的是L3处理,接近于生物饵料培养结果。虽然在生长上的差异并不显著,但成活率上却出现了较大差异,这种情况说明相当多的个体可能是处于迥异的生理状态。试验5,以蛋白质含量为48%,而脂类含量为15、20、25、30%饲料投喂的稚鱼为研究对象,分别测定脑、肠道、鳃与肌肉的SOD、CAT、GPX活性和MDA含量,研究各部组织对饲料脂类水平的抗氧化酶活性与脂类过氧化产物间的相互关系。结果表明:（1）肠道GPX活性结果显示,对照组最高,而且随着养殖时间的延长呈升高趋势,后期肠道酶活性与开始阶段差异显著。各脂肪饲料处理中,GPX活性呈逐渐增强的趋势;肌肉GPX活性没有呈现出明显的规律性,但高脂类饲料（30%）酶活性随着时间的延长有下降的趋势;鳃GPX活性,只有L1星降低趋势,而试验后期其数值相对稳定,但均低于开始阶段的活性水平;L3的活性水平均高于对照,在试验后期与对照组间的差异显著（p＜0.05）,而对照组的活性水平经前期的升高后,呈现下降趋势;脑GPX活性,对照呈现明显的下降趋势,而L1处理除第10d稍高外,后期活性均下降,L3、L4的GPX活性随时间逐渐升高,以L4的40d活性最高且与其他处理差异显著。测定组织的GPX活性相比较发现,消化道中GPX活性最高,说明作为脂类主要吸收部位的肠道,酶活性的升高有利于鱼类防止自由基的伤害。（2）消化道CAT,在各试验阶段中,L4活性均高于其他处理,而且差异显著,但经10d的短暂升高后,其活性呈下降趋势,而L2和L3活性相差不大,且均高于同期对照,与对照初期的活性相近,呈现出相对稳定状态;各处理的肌肉CAT活性均显著高于对照,其中L4的活性显著升高,在试验后期显著高于其他处理,表现为最高活性,而L1与L3活性经短期升高后,出现逐步下降但始终与对照差异显著,即LA过高的脂类水平使肌肉的氧化反应增强;鳃各处理CAT活性均显著高于对照,而L3的活性保持相对稳定的高水平,而且与各处理差异不显著;对照组脑的CAT活性相对稳定,而其他处理均较高,以L4的活性最高,显著高于各处理,表现为高脂水平下的高活性。由酶活性的分布来看,肌肉的数值相对较低,而其他组织间没有明显的活性差别,尤其在L4的脑活性较高。饲料脂类水平的升高,在一定范围内并没有对CAT活性产生显著影响,但过高就可能加剧了CAT的产生,间接表明过氧化氢可能出现了升高,即过氧化反应增强。酶活性的升高可能说明组织内部过氧化反应较强烈,可能会影响到鱼类的正常生理机能。（3）肠道SOD活性,除L1活性略有下降外,各处理的后期活性均高于试验初期水平,以LA水平最高,且与其他处理差异显著。除个别时段对照的活性略低外,L1、L2、L3均与对照相差不显著;肌肉L3与L4处理的酶活性始终处于较高水平,与其它处理间差异显著,以L4在第30d活性最高,且保持上升趋势,而对照组活性相对稳定,前期与L1接近;鳃L1与L3处理的活性呈线性上升趋势,而L2与L4呈现为线性下降,在试验后期,L2、L3、L4活性间差异并不显著,而L1活性显著高,表现为活性与低水平脂类间的相关;脑活性均较高,在300～500U/mg prot之间,与对照相比,各处理活性均较高而且呈上升趋势,试验后期,L2、L3与L4的活性水平相近,没有差异,而L1活性水平较低,差异显著。通过上述结果可以断定,饲料脂类水平对组织SOD活性的改变是一个正向调节的关系。高水平的脂类影响到了鱼体SOD活性,这种情况可能是由于活性氧的产生量提高所造成的,而鱼体可以通过活性增量调节来应答。（4）肠道对照组MDA含量比较稳定,在0.50～0.61 nmol/mg prot之间。而各处理含量均高于对照,以L4含量最高,且与其他处理间差异显著;肌肉对照MDA含量呈小幅下降趋势,而除L1在试验初期的含量稍低外,各处理数据均高于对照,L1的含量最高,与其它处理差异明显,且呈现为上升趋势;鳃对照组含量相对稳定,为0.34～0.37 nmol/mg prot之间,而在第10d时L1和L2的含量出现剧烈下降,在第20d时有所上升,但L1在第30d时仍然很低,L4含量始终处于较高水平,显著高于其他处理;脑对照组含量呈下降趋势,较其他处理稍低。在第20和30d,L4含量均高出其它结果,且差异显著。L3的数值在后期相对稳定且稍低于L2,但与L2没有显著差异,而L4的MDA水平相对较高且稳定,说明高脂类水平可能影响到了脑的过氧化反应。上述结果显示,脂类水平会影响到肠道MDA的产生,并会对脑的氧化反应造成影响,这种影响可能会造成组织的氧化损伤,但鱼类可以通过自身的抗氧化酶防御系统得到调节,实现保护。而过高水平的脂类可能已经超出了自身保护能力而造成组织损伤,进而影响成活。本课题通过以上试验证实了细鳞鱼稚鱼已经具备了对营养物质消化的相关酶类,而且饲料中48%蛋白与20-25%的脂类含量,可以促进消化酶的分泌与消化道成熟,表现为生长速度和成活率的提高。抗氧化酶与脂类代谢产物的分析结果证明了鱼类可以通过自身酶活性的调节来防御过氧化物的损伤,到过高的脂类水平会影响到鱼体的正常生长。饲料脂类水平对鱼体生理可能的作用机理是:适量添加饲料中蛋白质与脂类含量能够促进脂类消化酶的分泌与刷状缘膜酶活性的升高,提高细胞外消化水平,同时通过提高肠道与肌肉的SOD、CAT和GPX活性,增强吸收与储存位点的抗氧化能力,促进营养物质的储留,进而提高生长与存活。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 前言
• 1.1 细鳞鱼资源状况
• 1.2 稚鱼营养的消化酶与饲料调节
• 1.2.1 稚鱼营养研究现状
• 1.2.2 蛋白酶与分泌调节
• 1.2.3 肠酶
• 1.2.4 脂类分解酶的调节
• 1.2.5 营养物质对发育有关代谢途径的调节
• 1.3 鱼类肠道结构与刷状缘膜囊的制备技术
• 1.3.1 肠道形态学
• 1.3.2 刷状缘膜囊的制备技术
• 1.4 消化酶的组织化学研究
• 1.4.1 消化酶的发育规律
• 1.4.2 消化酶的组织化学研究
• 1.5 脂类营养对鱼类消化道发育的影响
• 1.5.1 稚鱼消化能力
• 1.5.2 脂酶活性的日粮调节
• 1.5.3 饲料脂类水平对营养物质吸收的影响
• 1.5.4 脂肪酸吸收
• 1.5.5 饲料脂类对摄食量的影响
• 1.5.6 存在的问题
• 1.6 鱼类抗氧化机能研究与营养
• 1.6.1 抗氧化防御与系统发生地位
• 1.6.2 抗氧化防御和老化
• 1.6.3 抗氧化防御、摄食行为与营养因子
• 1.6.4 抗氧化防御、鱼类行为与环境因素
• 1.6.5 抗氧化防御与外源化学物质
• 1.6.6 抗氧化防御和寄生虫感染
• 1.7 本试验的设计与目的
• 2 材料与方法
• 2.1 消化道组织学与酶组织化学研究
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 试验方法
• 2.2 肠道刷状缘膜分离技术的研究
• 2.2.1 仪器与试剂
• 2.2.2 试验动物与试验设计
• 2.2.3 BBMV的制作方法
• 2.2.4 指标检测
• 2.2.5 统计分析
• 2.3 稚鱼蛋白质与脂类营养需求的研究
• 2.3.1 试验条件
• 2.3.2 试验饲料设计与分析
• 2.4 高脂饲料对稚鱼消化酶分泌与刷状缘膜发育的影响的研究
• 2.4.1 材料
• 2.4.2 方法
• 2.5 高脂肪饲料对抗氧化生理机能影响研究
• 2.5.1 材料
• 2.5.2 方法
• 3 结果与分析
• 3.1 消化道组织学与酶组织化学研究
• 3.1.1 组织学观察结果
• 3.1.2 酶组织化学观察结果
• 3.2 肠道刷状缘膜分离技术的研究
• 3.2.1 酶活性与富积系数
• 3.3 稚鱼蛋白质与脂类营养需求的研究
• 3.3.1 成活率
• 3.3.2 体长测定结果
• 3.3.3 体重测定结果
• 3.4 高脂饲料对稚鱼消化酶分泌与刷状缘膜发育的影响的研究
• 3.4.1 γ-GT活性
• 3.4.2 AKP活性
• 3.4.3 胰蛋白酶活性
• 3.4.4 脂肪酶活性
• 3.4.5 淀粉酶活性
• 3.4.6 增重与存活率
• 3.5 饲料脂肪对抗氧化生理机能影响研究
• 3.5.1 组织GPX测定结果
• 3.5.2 组织CAT测定结果
• 3.5.3 组织SOD活性测定
• 3.5.4 MDA含量测定
• 4 讨论
• 4.1 消化道组织学与酶组织化学研究
• 4.1.1 消化道组织学
• 4.1.2 消化酶组织化学
• 4.1.3 小结
• 4.2 肠道刷状缘膜分离技术的研究
• 4.2.1 常用分离技术的缺点
• 4.2.2 本试验的优势
• 4.2.3 小结
• 4.3 稚鱼蛋白质与脂类营养需求的研究
• 4.3.1 蛋白质与脂肪需求
• 4.3.2 小结
• 4.4 高脂饲料对稚鱼消化酶分泌与刷状缘膜发育的影响的研究
• 4.4.1 肠道刷状缘膜水解酶
• 4.4.2 胰蛋白酶活性
• 4.4.3 脂肪酶
• 4.4.4 AMS活性
• 4.4.5 增重与成活率
• 4.4.6 小结
• 4.5 高脂肪饲料对抗氧化生理机能影响研究
• 4.5.1 GPX活性
• 4.5.2 CAT活性
• 4.5.3 SOD活性
• 4.5.4 MDA含量
• 4.5.5 小结
• 5 结论与建议
• 5.1 本研究主要结论
• 5.2 本研究主要创新
• 5.3 有待进一步研究和解决的问题
• 致谢
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文