八棱海棠actin基因的克隆与GO基因转化拟南芥研究

论文摘要

本文通过RACE技术克隆了八棱海棠的肌动蛋白基因,5’-RACE获得长度1121bp的片段、3’-RACE获得883bp的片段,再通过设计引物扩增得到八棱海棠中肌动蛋白基因的cDNA的全长序列。该序列全长1134bp,推测其编码377个氨基酸,等电点为5.16。并分析了其作为内标的可能性。通过实验验证其可以作为内标用于八棱海棠其它基因的表达情况研究。过氧化氢（H2O2）在植物受到病原微生物侵染后引发的一系列防御反应中起着非常重要的作用,因此通过外源基因导入提高植物体内过氧化氢的含量,可以增强植物的广谱抗病性。葡萄糖氧化酶（glucose oxidase,GO）可以催化β-D-葡萄糖氧化生成过氧化氢和葡萄糖酸,此酶已在数种细菌和真菌中检测到,但在植物和动物中仍未发现。本研究通过构建含GO基因的植物双元载体,通过农杆菌介导法,用CaMV35S启动子控制GO基因表达的植物双元载体转化拟南芥,对GO基因进行功能鉴定。通过农杆菌蘸花法共获得12株拟南芥阳性植株,GUS染色和PCR鉴定结果初步显示,外源的GO基因已经整合到转基因的拟南芥基因组中。RT-PCR分析结果显示,GO基因在转基因拟南芥中已经表达。通过对转基因和对照的拟南芥的过氧化氢的含量测定,观测到转基因的拟南芥的过氧化氢含量要高于对照的拟南芥。通过对转基因的植株和非转基因植株的DAB染色,结果表明转基因拟南芥中积累的深棕色物质要比对照的拟南芥多。通过对转基因和对照拟南芥类黄酮含量测定,分析结果显示转基因植株的类黄酮含量比对照高。此外,转基因植株的抗病性也比对照显著提高。然后准备构建植物双元表达载体,通过农杆菌介导法将GO基因转入八棱海棠,运用MrACT作为内标,来研究相关基因的表达情况。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 缩略语
• 第一章 文献综述
• 1 肌动蛋白基因的研究进展
• 1.1 肌动蛋白基因的发现
• 1.2 肌动蛋白基因的功能
• 1.3 肌动蛋白基因研究现状
• 2 植物抗氧化、抗病性研究进展
• 2.1 过氧化氢等活性氧类在植物-病原微生物互作中的作用
• 2.2 AOS在植物抗病性中的作用
• 2.3 植物中的抗氧化代谢
• 2.4 葡萄糖氧化酶基因及其在植物抗病基因工程中的作用
• 3 RACE技术的研究进展
• 3.1 RACE技术原理
• 3.2 几种常见的RACE技术
• 3.3 RACE技术在植物基因分离中的应用
• 3.4 RACE步骤的改良
• 4.本研究的研究目的及其研究内容
• 第二章 八棱海棠肌动蛋白基因的克隆和初步分析
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 2 实验方法
• 2.1 RACE cDNA文库的构建
• 2.2 目的基因保守结构域的获得
• 2.3 目的片段回收,克隆,鉴定及测序
• 2.4 3'RACE
• 2.5 5'RACE
• 2.6 生物信息学分析
• 2.7 植物材料处理
• 2.8 总RNA的抽提（CTAB法）
• 2.9 总RNA中基因组DNA的去除
• 2.10 反转录合成cDNA第一链
• 3.结果与分析
• 3.1 八棱海棠总RNA的抽提
• 3.2 八棱海棠MrACT保守结构域的获得
• 3.3 3'RACE和5'RACE
• 3.4 MrACT全长的获得及预测的氨基酸序列
• 3.5 MrACT同源性分析
• 3.6 MrACT二维结构分析
• 3.7 八棱海棠MrACTIN基因表达分析
• 4.讨论
• 第三章 葡萄糖氧化酶基因转入拟南芥及其功能鉴定
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 含双CAMV35S启动子的双元载体YG8436的构建
• 1.2.2 拟南芥转化
• 1.2.3 GUS组织化学染色分析
• 1.2.4 转基因植株的PCR检测
• 1.2.5 转基因植株DAB染色
• 2O₂含量测定'>1.2.6 转基因植株H₂O₂含量测定
• 1.2.7 转基因植株类黄酮含量测定
• 1.2.8 转基因植株抗病性分析
• 2 结果与分析
• 2.1 GO基因的农杆菌转化双元载体的构建
• 2.2 转基因纯系植株的获得与鉴定
• 2.3 转基因植株功能的鉴定
• 3 讨论
• 全文总结和后续研究
• 1 全文结论
• 2 后续研究
• 参考文献
• 硕士期间发表的文章
• 致谢