论文摘要
目的:本研究通过构建STAT3基因siRNA重组质粒,转染食管癌Eca-109细胞,特异性阻断STAT3基因的表达,联合不同剂量的X线照射,观察放射合并RNA干扰对细胞增殖、细胞周期、凋亡和放射增敏性的影响,初步探讨其放射增敏机制,为寻找食管癌的放射增敏靶点、提高食管癌的放疗疗效提供实验依据。方法:1、免疫细胞化学法、Western blot方法检测食管癌Eca-109细胞中STAT3蛋白表达。2、针对人STAT3基因mRNA序列,构建3个siRNA重组质粒:pRNAT-U6.1-siRNA1、pRNAT-U6.1-siRNA2、pRNAT-U6.1-siRNA3,同时构建1个阴性重组质粒:pRNAT-U6.1-negative。重组质粒测序鉴定。3、重组质粒转染Eca-109细胞,G418筛选获得稳定表达siRNA的细胞克隆,RT-PCR、Western blot方法检测细胞STAT3 mRNA及蛋白表达。4、MTT法、流式细胞仪分别检测STAT3-siRNA对细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响。5、Eca-109细胞分别接受0、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy X线照射,MTT法、平板克隆形成实验分别计算细胞存活分数,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡。6、稳定表达siRNA的细胞分别接受0、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy X线照射,MTT法、平板克隆形成实验分别计算细胞存活分数,流式细胞仪检测4Gy X线照射的细胞周期和凋亡。结果:1、细胞免疫化学法和Western blot方法检测证实,食管癌Eca-109细胞中有STAT3蛋白表达。2、成功构建了3个STAT3基因siRNA重组质粒,经测序鉴定正确。3、RT-PCR、Western blot方法分析显示,转染pRNAT-U6.1-siRNA3重组质粒可明显抑制肿瘤细胞STAT3 mRNA和蛋白的表达,而pRNAT-U6.1-siRNA1和pRNAT-U6.1-siRNA2重组质粒对STAT3基因的抑制作用不明显。4、MTT实验证实,siRNA3治疗组肿瘤细胞生长抑制率为35.68%,明显高于对照组,差异有统计学意义（p＜0.01）。5、流式细胞仪检测证实,siRNA3治疗组G0/G1期细胞占79.51%,较对照组明显增高,差异有统计学意义（p＜0.05）;细胞凋亡率为13.26%,较对照组明显增加,差异有统计学意义（p＜0.01）。6、6Gy、8Gy X线照射,Eca-109细胞存活分数分别为44.28%、16.74%,较2Gy、4Gy X线照射明显降低,差异有统计学意义（p＜0.01）。7、4Gy、6Gy、8Gy X线照射,Eca-109细胞中G2/M期细胞分别占11.7%、14.08%、24.27%,较0、2Gy X线照射明显增高,差异有统计学意义（p＜0.01）。不同剂量X线照射引起的细胞凋亡率差异无统计学意义（p＞0.05）。8、不同剂量X线照射,siRNA3治疗组细胞存活分数均低于对照组,差异有统计学意义（p＜0.01）。9、4Gy X线照射,siRNA3治疗组G0/G1期细胞占83.79%,较对照组明显增高,差异有统计学意义（p＜0.01）;细胞凋亡率为16.42%,较对照组明显增加,差异有统计学意义（p＜0.01）。10、经计算本研究的放射增敏比为1.334,提示RNA干扰STAT3基因对放射有增敏作用。结论:1、食管癌Eca-109细胞中有STAT3蛋白表达。2、成功构建了3个STAT3基因siRNA重组质粒pRNAT-U6.1-siRNA,经测序鉴定正确。3、pRNAT-U6.1-siRNA3重组质粒能有效地抑制肿瘤细胞STAT3 mRNA和蛋白的表达。4、STAT3-siRNA可抑制Eca-109细胞增殖、引起细胞周期G0/G1期阻滞、诱导肿瘤细胞凋亡。5、单纯照射可抑制Eca-109细胞的增殖、引起细胞周期G2/M期阻滞,但是未诱导明显的肿瘤细胞凋亡。6、放射合并STAT3-siRNA可明显抑制Eca-109细胞的增殖、引起细胞周期G0/G1期阻滞、诱导肿瘤细胞凋亡。7、RNA干扰STAT3基因的表达对肿瘤细胞有放射增敏作用,可以提高Eca-109细胞的放射敏感性。
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