家蚕幼虫马氏管免疫相关基因的研究

论文摘要

家蚕是典型的鳞翅目模式昆虫,完全依赖于人类才能繁衍的重要经济昆虫,对于家蚕马氏管免疫相关基因的研究,不仅能了解家蚕免疫应答的分子调控机制,也有助于对其他昆虫的分子免疫调控机制的理解。模式昆虫果蝇的马氏管可作为自主免疫组织,当机体受到微生物侵染时,能独立于脂肪体启动有效的免疫应答产生抗菌肽保护机体免受微生物的侵染,我们以此为依据开展家蚕马氏管免疫相关功能基因的研究。为了探讨家蚕幼虫马氏管的蛋白质组学及其免疫功能,本文借助蛋白双向电泳技术（2-D）对感染BmNPV不同时相的家蚕幼虫马氏管蛋白进行分离,随后利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOFMS）对其中14个差异蛋白点进行质谱分析。结果表明:10个蛋白点得到成功鉴定,分别为NADPH-specific isocitrate Dehydrogenase、泛醇-细胞色素C还原酶核心蛋白Ⅱ、蛋白二硫键异构酶、丙酮酸脱氢酶E1复合物β亚基、天冬氨酸转氨酶、乙酰乙酰基辅酶A硫解酶、3-羟基异丁酸脱氢酶、羟基丙酮酸异构酶/一氧化氮合酶、质子转移ATP合酶β亚基、ATP合酶。其中质子转移ATP合酶β亚基在马氏管内已见报道,本文对另一可信结果家蚕一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase ;简称BmNOS）做进一步的研究。由于诱导型BmNOS是合成巨噬细胞免疫效应因子NO的一种关键特异性蛋白酶,故本文通过体内注射BmNPV和LPS两种诱导剂,采用半定量和实时荧光定量PCR的方法,对感染组和对照组马氏管中BmNOS的不同感染时期的表达进行了定量分析。结果表明:经两种诱导剂处理3h后,处理组BmNOS表达量均呈迅速递增,BmNPV侵染组上调约7倍,LPS处理组除3h表达量上调25倍外,该趋势持续到6h处理组仍表现出明显的上调趋势,随后逐渐降低并趋于平稳的趋势,推测BmNOS在家蚕马氏管的免疫中具有重要的功能。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
• 1.1 研究背景和选题意义
• 1.1.1 家蚕马氏管
• 1.1.2 家蚕内生免疫系统
• 1.1.3 果蝇体液免疫的研究进展
• 1.1.4 果蝇马氏管的免疫学研究
• 1.1.5 NO与免疫
• 1.2 本课题研究的主要内容
• 第2章 家蚕马氏管内生免疫蛋白质组的研究
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 生物材料的准备
• 2.2.2 试剂及实验仪器
• 2.2.3 试验方法
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 家蚕幼虫马氏管侵染BmNPV后各时相双向电泳结果
• 2.3.2 差异蛋白点质谱鉴定结果
• 2.4 讨论
• 2.5 本章小结
• 第3章 诱导剂诱导后马氏管内BmNOS基因的表达差异
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料及试剂
• 3.2.1 实验材料的准备
• 3.2.2 工具酶和其他试剂
• 3.2.3 常用试剂的配制
• 3.2.4 主要的实验仪器和设备
• 3.2.5 引物设计
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 家蚕各时相马氏管总RNA 的提取
• 3.3.2 反转录反应
• 3.3.3 PCR 验证
• 3.3.4 琼脂糖凝胶的制备与电泳
• 3.3.5 玻璃奶回收DNA
• 3.3.6 目的片段与pMD18-T载体的连接
• 3.3.7 质粒DNA 的转化
• 3.3.8 快速破碎法鉴定重组质粒
• 3.3.9 碱裂解法少量提取质粒DNA
• 3.3.10 重组质粒DNA 的酶切鉴定
• 3.3.11 甘油菌的制备及序列测定
• 3.3.12 半定量RT-PCR 检测
• 3.3.13 荧光定量PCR 反应
• 3.4 实验结果
• 3.4.1 家蚕BmNOS基因区域片段的扩增
• 3.4.2 重组质粒pMD18-T-BmNOS的酶切鉴定
• 3.4.3 重组质粒pMD18-T-BmNOS的测序结果与序列分析
• 3.4.4 不同时相家蚕马氏管组织总RNA 的提取
• 3.4.5 侵染BmNPV不同时相的BmNOS基因转录水平的变化
• 3.4.6 LPS诱导不同时相BmNOS基因转录水平的变化
• 3.5 讨论
• 3.6 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢
• 详细摘要