黄孢原毛平革菌抗营养阻遏产酶和降解木质素机制研究

论文摘要

白腐真菌是指一类能引起木质白色腐烂的丝状真菌的集合。凭借其选择性降解木质素的能力,它的菌丝能穿入木质,释放降解木质素的酶,从而导致木质腐烂,变成海绵状的团块即白腐。黄孢原毛平革菌是白腐菌研究的模式菌种,是真菌生物技术系统的代表菌种。白腐菌在氮、碳、硫等营养限制条件下能产生特殊的酶,包括木质素过氧化物酶（LiP）、锰过氧化物酶（MnP）和漆酶（Lac）等,这些酶能够有效地降解木质素。白腐菌是自然界中唯一能够独立并且彻底降解木质素的微生物。可是环境多属于富营养环境,这就限制了黄孢原毛平革菌在实际中的应用。同时,在黄孢原毛平革菌的培养过程中,其代谢活动如木质素降解酶的产生及其酶活性等,受培养因子的影响非常大。而且白腐菌生物降解酶系统的形成不能以木质素作为其唯一的碳源,它需要一种共底物如葡萄糖等。若黄孢原毛平革菌能以木质素或其它降解底物作为唯一的碳源,那无疑将会有广阔的应用前景。同时,因菌体生长与酶合成不同步使其酶产量也难以得到实质性的提高。前人在大量的实验基础上,经紫外诱变选育得到了3株在富氮条件下能高效合成木质素酶系且菌体生长快的菌株PC5324、PC5326、PC5305。本论文即是对这些突变菌株进行较系统的研究,包括不同菌株木质素同工酶类型与产生机制、诱变菌株木质素生物降解机制等,得到如下结果：（1）分别进行出发菌株和诱变菌株在限氮和富氮条件下的过氧化物酶同工酶差异比较,发现过氧化物同工酶显示的酶谱带为1-5条不等,酶谱带颜色的深浅和宽度在一定程度上与酶活高低相关。不同菌株过氧化物酶同工酶在质（酶带的数目和相对迁移率）和量（酶的活性）上表现出一定程度的差异,但部分酶带的排列具有一定的规律性。总体上,诱变菌株PC5305表现出酶带染色最深色和最宽酶带宽度,诱变菌株PC5324表现出酶带染色深色,诱变菌株PC5326表现出酶带染色浅深色,出发菌株PC553表现出酶带染色浅色和最窄酶带宽度。（2）通过出发菌株和诱变菌株菌体生长与产酶相关性分析发现,出发菌株PC553属于营养阻遏菌株,即生长和产酶不同步；而诱变菌株打破了该规律,即生长量和产酶可以同时达到最高峰,并且诱变菌株的生长量和酶活性都远高于出发菌株。通过研究出发菌株和诱变菌株在限氮和富氮条件下氮消耗曲线和碳消耗曲线,发现了触发各菌株进入次生生长阶段的氮、碳浓度临界点。在限氮条件下,PC553、PC5324、PC5326、PC5305进入次生代谢的氮浓度临界点分别为：O.10g/L,0.11 g/L,0.14 g/L,0.16 g/L;碳浓度临界点分别为：12.0 g/L,13.0 g/L,17.0 g/L,18.0 g/L;在富氮条件下,PC553、PC5324、PC5326、PC5305进入次生代谢的氮浓度临界点分别为0.9 g/L,1.3 g/L,1.6 g/L,1.9 g/L;碳浓度临界点分别为：14.0g/L,15.2 g/L,14.6 g/L,16.9 g/L。探究了不同营养条件下出发菌株和诱变菌株的生理调控机制,寻找变化规律并探究原因。与出发菌株不同的是,PC5305在限氮条件下最佳培养基条件为锌离子浓度0.8g/L,锰离子浓度0.2g/L,草酸浓度0.3g/L,苯丙氨酸浓度0.2g/L。在富氮条件下最佳培养基条件为锌离子浓度0.6g/L,锰离子浓度0.4g/L,草酸浓度0.3g/L,苯丙氨酸浓度0.4g/L。（3）探究出发菌株和诱变菌株的木质素降解机制,发现出发菌株不能以木质素作为其唯一碳源,而诱变菌株PC5305则打破了木质素必须被共代谢的规律,即可以以木质素作为其唯一碳源。其在其他营养成分的情况下,对木质素的降解率可以达到25%左右。探究了诱变菌株PC5305在不同环境条件下木质素降解机制,寻找变化规律并探究原因,发现各因素对PC5305木质素磺酸钙降解率的影响程度不同,影响大小为培养温度>苯甲醇浓度>pH>吐温80浓度。PC5305对木质素磺酸钙降解率的最佳培养条件为温度37℃,pH值4.5,苯甲醇浓度5.2mmol/L,吐温80浓度1.0g/L。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 白腐菌的生长代谢特点及降解木素酶系
• 1.1.1 白腐菌的生长代谢特点
• 1.1.2 白腐菌降解木素酶系及其作用特点
• 1.2 白腐菌过氧化物酶同工酶凝胶电泳分析
• 1.2.1 电泳技术
• 1.2.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 1.2.3 白腐菌过氧化物酶同工酶
• 1.3 白腐菌营养机制研究的国内外现状
• 1.4 白腐菌木质素降解研究
• 1.4.1 白腐菌木质素降解机制
• 1.4.2 白腐菌木质素降解研究的国内外现状
• 1.5 本论文的研究目的和意义
• 1.6 本论文的研究内容
• 2 实验材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验菌种
• 2.1.2 实验主要药品
• 2.1.3 实验器材
• 2.1.4 实验培养基
• 2.1.5 实验试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 过氧化物酶（POD）同工酶分析
• 2.2.2 出发菌株和诱变菌株的产酶机制研究
• 2.2.3 出发菌株和诱变菌株的木质素生物降解机制研究
• 3 结果与分析
• 3.1 过氧化物酶（POD）同工酶分析
• 3.1.1 不同菌株过氧化物酶同工酶酶谱特征
• 3.1.2 迁移距离
• 3.1.3 过氧化物酶同工酶的相对迁移率（Rf）
• 3.2 出发菌株和诱变菌株的产酶机制研究
• 3.2.1 出发菌株和诱变菌株的生长曲线与产酶曲线
• 3.2.2 出发菌株和诱变菌株的C、N消耗曲线
• 3.2.3 不同营养条件下抗营养阻遏产酶的生理调控机制
• 3.2.4 Zn、Mn、草酸、苯丙氨酸的正交试验
• 3.3 出发菌株和诱变菌株的木质素生物降解机制研究
• 3.3.1 木质素磺酸钙降解率测定
• 3.3.2 不同环境条件下诱变菌株木质素降解机制
• 3.3.3 温度、初始pH、苯甲醇、Tween80的正交试验
• 4 小结
• 4.1 实验结论
• 4.2 展望
• 参考文献
• 致谢