本文主要研究内容
作者李佳慧,杨芳芳,王珍,张赛南,王首锋（2019）在《新型双功能谷胱甘肽合成酶的真核和原核表达》一文中研究指出：通过裂解无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）菌体细胞得到基因组DNA。根据GenBank上已发表的无乳链球菌（菌种编号ATCC13813）新型双功能谷胱甘肽合成酶基因（gshF）的核酸序列与2种不同表达载体多克隆位点序列,分别设计引物F1、R1和F2、R2,再以总DNA为模板,经过特异性PCR扩增出长度约为2 200 bp的目的基因。随后分别对目的基因gshF和2种表达载体进行双酶切、连接等操作,得到表达载体pPIC9K-gshF与pET-gshF。用Sal I线性化表达载体pPIC9K-gshF后电转至毕赤酵母GS115中。经MD平板筛选重组子、菌落PCR鉴定阳性菌株、G418抗性梯度平板筛选多拷贝菌株,最终在4.0 mg·mL-1G418抗性平板上筛选出阳性菌株。用甲醇终浓度为2%的BMMY培养基诱导该阳性菌株表达,每隔12 h取样并添加甲醇,96 h后离心收集发酵上清,经SDS-PAGE蛋白电泳显示:在85 kDa处出现1条明显蛋白带,大小与预期GshF蛋白一致。重组菌BL21-pET-gshF用IPTG诱导表达,先在37℃下培养90 min,再加入IPTG至1 mmol·L-1后诱导7 h,离心收集表达产物并对重组菌进行超声破碎处理后,进行SDS-PAGE蛋白电泳,同样在85 kDa处有1条蛋白带。采用Bradford法测定2种表达产物上清的蛋白量,其中重组酵母表达上清中蛋白量为0.46 mg·mL-1,重组大肠杆菌表达产物破壁后的蛋白量为1.46 mg·mL-1。测定并比较2种不同表达方式所得酶活,发现GshF在毕赤酵母表达中的比酶活仅为14.15 U·mL-1,经原核表达后比酶活可达62.15 U·mL-1。
Abstract
tong guo lie jie mo ru lian qiu jun （Streptococcus agalactiae）jun ti xi bao de dao ji yin zu DNA。gen ju GenBankshang yi fa biao de mo ru lian qiu jun （jun chong bian hao ATCC13813）xin xing shuang gong neng gu guang gan tai ge cheng mei ji yin （gshF）de he suan xu lie yu 2chong bu tong biao da zai ti duo ke long wei dian xu lie ,fen bie she ji yin wu F1、R1he F2、R2,zai yi zong DNAwei mo ban ,jing guo te yi xing PCRkuo zeng chu chang du yao wei 2 200 bpde mu de ji yin 。sui hou fen bie dui mu de ji yin gshFhe 2chong biao da zai ti jin hang shuang mei qie 、lian jie deng cao zuo ,de dao biao da zai ti pPIC9K-gshFyu pET-gshF。yong Sal Ixian xing hua biao da zai ti pPIC9K-gshFhou dian zhuai zhi bi chi jiao mu GS115zhong 。jing MDping ban shai shua chong zu zi 、jun la PCRjian ding yang xing jun zhu 、G418kang xing ti du ping ban shai shua duo kao bei jun zhu ,zui zhong zai 4.0 mg·mL-1G418kang xing ping ban shang shai shua chu yang xing jun zhu 。yong jia chun zhong nong du wei 2%de BMMYpei yang ji you dao gai yang xing jun zhu biao da ,mei ge 12 hqu yang bing tian jia jia chun ,96 hhou li xin shou ji fa jiao shang qing ,jing SDS-PAGEdan bai dian yong xian shi :zai 85 kDachu chu xian 1tiao ming xian dan bai dai ,da xiao yu yu ji GshFdan bai yi zhi 。chong zu jun BL21-pET-gshFyong IPTGyou dao biao da ,xian zai 37℃xia pei yang 90 min,zai jia ru IPTGzhi 1 mmol·L-1hou you dao 7 h,li xin shou ji biao da chan wu bing dui chong zu jun jin hang chao sheng po sui chu li hou ,jin hang SDS-PAGEdan bai dian yong ,tong yang zai 85 kDachu you 1tiao dan bai dai 。cai yong Bradfordfa ce ding 2chong biao da chan wu shang qing de dan bai liang ,ji zhong chong zu jiao mu biao da shang qing zhong dan bai liang wei 0.46 mg·mL-1,chong zu da chang gan jun biao da chan wu po bi hou de dan bai liang wei 1.46 mg·mL-1。ce ding bing bi jiao 2chong bu tong biao da fang shi suo de mei huo ,fa xian GshFzai bi chi jiao mu biao da zhong de bi mei huo jin wei 14.15 U·mL-1,jing yuan he biao da hou bi mei huo ke da 62.15 U·mL-1。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自浙江大学学报(理学版)的李佳慧,杨芳芳,王珍,张赛南,王首锋，发表于刊物浙江大学学报(理学版)2019年04期论文，是一篇关于新型双功能谷胱甘肽合成酶论文,发酵表达论文,谷胱甘肽论文,浙江大学学报(理学版)2019年04期论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自浙江大学学报(理学版)2019年04期论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。