多杀菌素产生菌菌种选育与发酵工艺的初步研究

论文摘要

广谱生物杀虫剂多杀菌素是刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosad）发酵后的次级代谢产物,具有杀虫谱广,易降解,低残留,无抗药性,对人畜无害,环境污染少等优点,因而在农牧业上有着广阔的应用前景,有望成为我国生物农药产业一个新的经济增长点,该产品的开发具有很好的社会效益和经济效益。本文首先对斜面培养基、种子培养基、发酵培养基及培养条件进行了考察,确定了多杀菌素的基本发酵条件。其次,建立了多杀菌素产生菌菌种选育的初筛方法,通过验证琼脂块固体发酵与液体发酵的相关性以及TLC与HPLC的相关性,确定了琼脂块固体发酵与TLC相结合的筛选方法为有效的初筛方法,提高了菌种选育的效率。此外,本论文还通过考察确定了紫外线诱变与DES诱变的最适剂量：紫外线诱变15 s,DES处理45min,作用浓度为1%。本论文还考察了刺糖多孢菌对庆大霉素和红霉素的最高耐受剂量,建立了庆大霉素耐受筛选模型和红霉素耐受筛选模型。通过人工诱变和理性化筛选模型的应用,使多杀菌素的发酵单位由出发菌株的9.8gg·mL"1提高到57.5μg·mL-1。最后,本论文对多杀菌素的摇瓶发酵工艺进行了研究,优化了培养基组成和培养条件,考察了前体物质及其补入时间等因素对多杀菌素发酵的影响。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 多杀菌素的研发历程
• 1.2 菌种特性
• 1.3 多杀菌素的物理性质
• 1.4 多杀菌素的化学性质
• 1.5 多杀菌素的杀菌机制
• 1.6 多杀菌素的生物合成
• 1.6.1 多杀菌素生物合成简介
• 1.6.2 多杀菌素生物合成相关酶及基因簇
• 1.6.3 聚酮合成酶PKS基因
• 1.6.4 鼠李糖的合成、修饰与连接基因
• 1.6.5 刺糖多孢菌的基因改造
• 1.7 多杀菌素的国内研究现状
• 第二章 实验材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 仪器与设备
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 发酵工艺流程
• 2.2.2 多杀菌素含量的测定（高效液相色谱法）
• 2.2.3 发酵参数的测定
• 2.2.4 诱变处理
• 2.2.5 琼脂块固体初筛
• 2.2.6 薄层层析（TLC）检测法
• 2.2.7 菌种的保藏
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 培养基考察
• 3.1.1 斜面培养基的考察
• 3.1.2 种子培养基的考察
• 3.1.3 发酵培养基的考察
• 3.2 琼脂块筛选方法的建立
• 3.2.1 琼脂块培养基的筛选
• 3.2.2 琼脂块培养时间的考察
• 3.2.3 琼脂块固体发酵与摇瓶液体发酵相关性的考察
• 3.2.4 TLC检测方法的建立
• 3.2.5 琼脂块固体发酵方法的改进
• 3.2.6 琼脂块固体发酵法筛选高产菌株
• 3.3 菌种选育
• 3.3.1 诱变剂的选择
• 3.3.2 理性化筛选模型
• 3.3.3 高产菌株的遗传稳定性
• 3.3.4 高产菌株UDG-56的发酵代谢曲线
• 3.3.5 遗传谱系
• 3.4 发酵工艺的考察
• 3.4.1 种龄的考察
• 3.4.2 装瓶量的考察
• 3.4.3 接种量的考察
• 3.4.4 发酵周期的考察
• 3.4.5 发酵培养基的正交试验
• 3.4.6 前体对多杀菌素生物合成的影响
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢