论文摘要
目的:糖尿病肾病（Diabetic nephropathy,DN）是糖尿病严重并发症之一,它的危害巨大,不积极治疗,最终可发展成终末期肾衰竭。糖尿病肾病在美国和欧洲已成为引起终末期肾病的最常见病因,约占终末期肾病接受透析的40%。2001年,对我国30个省市自治区住院患者的调查发现,DN患病率约为33%,因此探索DN的发病机制及防治策略成为目前广大肾脏病学者关注的课题。研究认为,糖尿病肾病的发病机制与糖脂代谢紊乱、多元醇通路激活、蛋白激酶C激活、高血压所致的肾血流动力学改变、氧化应激、血管活性物质及细胞因子、遗传因素等多因素有关。DN的病变特征是肾小球肥大,其病理学基础是肾小球系膜细胞（glomerular mesangial cell, GMC）增殖、细胞外基质（extracellular matrix,ECM）积聚,从而导致肾小球高滤过和蛋白尿,最后导致肾小球硬化和肾间质纤维化。ECM的积聚是由于ECM合成增加和降解减少所致,多种原因,比如细胞因子或生长因子等促进了系膜增殖、系膜细胞肥大和基质分泌增加。同时还存在着ECM降解减少,目前已知道参与ECM降解的酶主要有三类:丝氨酸蛋白酶、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）及半胱氨酸蛋白酶。基质金属蛋白酶可以降解ECM中的Ⅳ型、Ⅴ型和Ⅵ型胶原。纤溶酶原激活物抑制物-1（plasminogen activator inhibitor, PAI-1）能够抑制丝氨酸蛋白酶,使ECM降解减少。它们的动态失衡直接参与了ECM的积聚。Megsin（mesangial cell-predominant gene with a homology to serpin）是一种系膜细胞优势表达基因,属serpin超家族成员,其能够与丝氨酸蛋白酶结合,发挥丝氨酸蛋白酶抑制剂活性。已有研究发现,在IgA肾病的系膜细胞中,其基因与蛋白表达水平显著上调。提示megsin作为serpin的成员,必定参与了GMC的某些病理生理过程。糖尿病肾病作为一种以系膜细胞增生和系膜基质积聚为主要病理改变的疾病,megsin基因怎样参与糖尿病肾病的发病过程及其作用途径如何目前尚未阐明。因此探讨megsin在GMC细胞外基质合成与降解中的作用对于深入揭示糖尿病肾病的发生机制具有重要意义。本课题建立糖尿病CD-1小鼠模型并转染Megsin基因,同时应用RNA干扰技术使megsin在小鼠肾脏组织中过表达或表达抑制,从整体、细胞和分子水平观察megsin、血小板衍生生长因子-BB（platelet-derived growth factor-BB , PDGF-BB ）、细胞外信号调节蛋白激酶1/2（extracellular signal-regulated protein kinase,ERK1/2）、转化生长因子β1（transforming growthfactor-β1,TGF-β1）、Ⅳ型胶原（collagen IV）等表达的变化,从而探讨megsin在糖尿病肾病发病过程中可能的细胞信号传导通路及其对ECM合成的影响;通过细胞外基质金属蛋白酶诱导因子（Extracellular matrix metalloproteinases inducer,EMMPRIN）、MMP-9及IV胶原表达的变化,探讨megsin对高糖环境下系膜细胞ECM降解的影响;通过药物干预,观察吡格列酮（pioglitazone）对高糖环境中megsin、MMP-2、PAI-1及IV型胶原表达的影响,为进一步探讨megsin在糖尿病肾损害中发病中的作用及其防治提供新的途径。方法:第一部分:选取清洁级健康雄性CD-1小鼠60只,行单侧肾切除,2周后切口完全愈合。随机抽取45只腹腔注射链尿佐菌素（streptozotocin,STZ）150mg/kg制备糖尿病小鼠模型。将检测成模的45只小鼠随机分为三组,构建megsin表达质粒并经尾静脉注射转染小鼠（D组,n=15）每周一次、单纯糖尿病组（B组,n=15）、糖尿病+空质粒转染组（C组,n=15）,将只做单侧肾切除的小鼠作为正常对照组（A组,n=15）。实验共12周,在2、4、12周末收集小鼠血液、尿液及肾组织标本,检测其血糖（BG）、血清肌酐（Scr）、小鼠肾重与体重比值（KW/BW）、尿蛋白（UP）。在2、4、12周末收集肾组织标本,分别应用免疫组化染色和蛋白印记法测定肾组织中megsin、PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1及IV型胶原的表达。建立稳定表达megsin小鼠系膜细胞株,高糖环境下培养48小时（D组）,同时设立小鼠系膜细胞低糖培养组（A组, 5.5mmol/L D-葡萄糖）、高糖培养组（B组,30mmol/L D-葡萄糖）、高糖+转染空质粒培养组（C组）和转染megsin质粒+高糖+ U0126组（E组）,分别于12、24、48小时末收集各组细胞及上清,提取蛋白,应用免疫细胞化学染色测定细胞中megsin、PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1及FN的表达,应用蛋白印记法测定各组总蛋白中megsin、PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1的表达,放免法测定细胞上清液中IV型胶原的浓度。第二部分:动物模型制备同第二部分,经尾静脉注射megsin siRNA质粒转染CD-1糖尿病小鼠（D组）,每周注射1次,并设立糖尿病组（B组）、糖尿病+空质粒转染组（C组）,单侧肾切除对照组（A组）,每组各15只小鼠,实验共12周,在2、4、12周末收集小鼠血液、尿液及肾组织标本,检测其BG、Scr)、小鼠肾重与体重比值（KW/BW）及UP。在2、4、12周末收集肾组织标本,分别应用免疫组化染色和蛋白印记法测定肾组织中megsin、PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1及IV型胶原的表达。体外培养小鼠系膜细胞,应用脂质体作为载体瞬时转染megsin siRNA质粒,在高糖环境下培养48小时（D组,）,并设立小鼠系膜细胞低糖培养组（A组,5.5mmol/L D-葡萄糖）、高糖培养组（B组,30mmol/L D-葡萄糖）、高糖+空质粒培养组（C组）,于12、24、48小时末收集每组细胞和上清,提取蛋白,应用免疫细胞化学染色测定细胞中megsin、PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1及纤维连接蛋白的表达,应用蛋白印记法测定各组总蛋白中megsin、PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1的表达,放免法测定细胞上清液中IV型胶原的浓度。第三部分:建立稳定表达megsin的小鼠系膜细胞,在高糖环境下培养48小时（D组）;应用脂质体2000作为载体瞬时转染megsin siRNA质粒,在高糖环境下培养48小时,（E组）,并设立小鼠系膜细胞低糖培养组（A组,5.5mmol/L D-葡萄糖）、高糖培养组（B组,30mmol/L D-葡萄糖）、高糖+空质粒培养组（C组）,分别于12、24、48小时末收集各组细胞及上清,提取蛋白,应用免疫细胞化学染色测定细胞中megsin、EMMPRIN及MMP-9的表达,应用蛋白印记法测定各组megsin、EMMPRIN和MMP-9蛋白的表达,放免法测定细胞上清液中IV型胶原的浓度。第四部分:取小鼠系膜细胞种植于96孔板,采用MTT法分别检测低糖、高糖及干预药物吡格列酮对系膜细胞增殖状态的影响。采用6孔板和25cm2塑料培养瓶培养细胞,将细胞分成3组:低糖组（A组,5.5mmol/L D-葡萄糖）、高糖组（B组,30mmol/L D-葡萄糖）、高糖+吡格列酮组（C组）,于48小时末收集各组细胞及上清,提取蛋白,应用免疫细胞化学染色测定细胞中megsin、EMMPRIN、MMP-2、PAI-1的表达,应用蛋白印记法测定各组总蛋白中megsin、EMMPRIN、MMP-2、PAI-1的表达,放免法测定细胞上清液中IV型胶原的浓度（结果用总蛋白校正）。结果:第一部分:1动物实验:与A组相比, B组、C组小鼠在第4周时可见KW/BW、Scr、UP升高（P<0.01）,D组升高更为明显（P<0.01）;12周时,上述改变更加显著。从第2周开始,光镜下观察B组、C组小鼠可见肾小球内细胞数增多,肾小球体积稍增大,系膜区基质增多;PAS染色可见阳性红染物质增加,Masson染色可见胶原纤维增多;D组变化较B组、C组明显;到12周末时上述变化更为显著。免疫组化及蛋白印记结果显示,与A组先比,第2周末即可见B组、C组、D组CD-1小鼠肾组织中megsin表达增强（P<0.01）,D组与B、C组相比,表达更加明显（P<0.01）。B组、C组、D组随着时间延长,megsin在肾组织的表达逐渐加强,至12周末表达最强,各时间点之间相比,具有统计学差异（P均<0.01）。B组、C组、D组PDGF-BB、pERK1/2、TGF-?1、FN及IV型胶原在第2周末表达增强,与A组相比具有统计学差异（P均<0.01）,D组与B、C组相比,表达更加显著（P均<0.01）。B组、C组、D组随着时间延长,上述指标在肾组织的表达逐渐加强,至12周末表达最强。蛋白印记检测megsin、PDGF-BB、pERK1/2及TGF-β1蛋白在各组、各时间点表达的结果与免疫组化相一致。2体外系膜细胞培养:免疫细胞化学结果显示,高糖培养组（B组）及转染空质粒组（C组）从12h开始,megsin、PDGF-BB表达即开始增强,且随时间表达有逐渐增强的趋势,至48小时表达最强,与A组同时相相比,差异具有统计学意义（P均<0.01）,两组各时间点之间相比,megsin及PDGF-BB表达也具有统计学意义（P均<0.01）。而经转染megsin质粒（D组）后,megsin及PDGF-BB表达在各时间点随时间延长表达显著增强,与B组各时相相比具有统计学意义（P均<0.01）。经过U0126干预（E组）后发现,在各时间点与D组相比,megsin、PDGF-BB表达没有显著降低（P均>0.05）。高糖培养组（B组）及转染空质粒组（C组）从12h开始,pERK1/2、TGF-?1及FN表达即开始增强,且随时间表达有逐渐增强的趋势,至48小时表达最强,与A组同时相相比,差异具有统计学意义（P均<0.01）,两组组各时间点之间相比,三者表达也具有统计学意义（P均<0.01）。而经转染megsin质粒（D组）后,pERK1/2、TGF-?1及FN表达在各时间点随时间延长表达显著增强,与B组各时相相比具有统计学意义（P均<0.01）。经过U0126干预（E组）后发现,在各时间点与D组相比,三者表达显著降低（P均<0.01）。蛋白印记法检测megsin、PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1蛋白在各组、各时间点表达与免疫细胞化学检测结果相一致。细胞上清液IV型胶原测定结果显示B组和C组上清液中IV型胶原含量随时间延长逐渐增加,48h达高峰,与A组同时相相比,其含量具有统计学差异（P均<0.01）;D组与B组同时相相比,上清液中IV型胶原的含量则随时间延长增加显著,差异具有统计学意义（P均<0.01）;与D组同时相相比,E组其含量则显著降低,具有统计学差异（P均<0.01）。第二部分:1.动物实验:B组、C组、D组小鼠注射STZ45天后即出现多饮、多食、多尿表现,而A组则无上述表现。B组、C组小鼠KW/BW、血清肌酐和UP在第2周开始升高,D组较A组略有下降,但与A组相比差异无统计学意义;与A组相比, B组小鼠从第4周开始,KW/BW、血清肌酐、UP升高（P<0.01）,C组升高更为明显（P<0.01）;D组与B组相比KW/BW、血清肌酐、UP下降（P<0.01）,12周时,上述改变更加显著。从第二周开始,光镜下观察B组、C组小鼠肾小球体积稍增大,基底膜普遍增厚,系膜区基质增多,D组变化较B组减轻;到12周末时上述变化更为显著。免疫组化和蛋白印记结果显示,与A组相比,B组从第二周开始,其肾小球megsin、PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1及IV型胶原表达增强（P<0.01）;D组转染megsin siRNA后,与B组相比肾小球megsin、PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1及IV型胶原表达减弱,差异具有统计学意义（P<0.01）;随着时间的延长,与A组相比,B组肾小球megsin、pERK1/2、PDGF-BB、TGF-β1及IV型胶原表达进一步加强（P<0.01）,12周是表达最强,D组上述各项指标较B组减弱（P<0.01）。B组和C组上述指标在各时间点相比差异无统计学意义（P>0.05）。2.细胞培养:免疫细胞化学及蛋白印记结果显示,从12小时开始,B组较A组小鼠系膜细胞megsin、PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1及FN表达及蛋白水平开始升高（P<0.01）,48小时达高峰,C组与B组相比差异无统计学意义（P>0.05）;D组与B组同期相比,megsin、PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1及FN表达及蛋白水平减弱,具有统计学差异（P<0.01）;从12小时开始,与A组相比,B组小鼠系膜细胞上清液中IV型胶原浓度（细胞总蛋白校正）开始升高,48小时达高峰（<0.01）,C组与B组同期相比差异无统计学意义（>0.05）,但D组与B组同期相比,系膜细胞上清液中IV胶原浓度显著下降,差异具有统计学意义（P<0.01）。第三部分:免疫细胞化学及蛋白印记结果显示,与A组相比,从12小时开始,B组小鼠系膜细胞megsin表达及蛋白水平开始升高（P<0.01）,48小时达高峰,C组与B组相比差异无统计学意义（P>0.05）;D组与B组同期相比,megsin表达及蛋白水平升高更加明显（P<0.01）;E组与B组、D组同期相比,megsin表达及蛋白水平均显著减弱（P<0.01）;从12小时开始,B组较A组EMMPRIN、MMP-9表达及蛋白水平下降,差异具有统计学意义（P<0.01）,48小时达高峰,C组与B组相比差异无统计学意义（P>0.05）;D组与B组同期相比,EMMPRIN、MMP-9表达及蛋白水平下降更加明显,具有统计学差异（P<0.01）;E组与B组、D组同时相相比,EMMPRIN及MMP-9表达明显增强及蛋白水显著升高（P<0.01）;从12小时开始,与A组相比,B组小鼠MC上清液中IV型胶原浓度（细胞总蛋白校正）开始升高,48小时达高峰（<0.01）,D组与B组相比,MC上清液中IV胶原浓度升高更明显（P<0.01）,E组与B组、D组同期相比,系膜细胞上清液中IV胶原浓度则有显著性下降,差异具有统计学意义（P<0.01）。第四部分:免疫细胞化学及蛋白印记结果显示,与A组相比, 48h时B组小鼠系膜细胞megsin、PAI-1表达及蛋白水平升高（P<0.01）,C组与B组同期相比,megsin及PAI-1表达减弱及蛋白水平降低（P<0.01）;B组较A组EMMPRIN、MMP-2表达减弱及蛋白水平下降（P<0.01）,C组与B组同期相比,EMMPRIN、MMP-9表达增强及蛋白水平升高,具有统计学差异（P<0.01）;与A组相比,B组小鼠系膜细胞上清液中IV型胶原浓度（细胞总蛋白校正）升高（<0.01）,C组与B组同期相比,系膜细胞上清液中IV胶原浓度明显下降（P<0.01）。结论:1动物实验及细胞培养研究表明,糖尿病状态下megsin基因在肾小球表达增强,与肾小球系膜增殖及ECM积聚相一致,提示megsin在糖尿病小鼠肾损害的发病机制中具有一定的作用。2过表达的megsin可促进糖尿病小鼠肾组织或系膜细胞ECM积聚,其作用机制一方面可能是通过PDGF-BB诱导的ERK通路激活,TGF-?1表达增加,使FN的表达及IV型胶原的含量增加而实现的;另一方面过表达的megsin可抑制糖尿病小鼠肾组织或系膜细胞EMMPRIN、MMP-9的表达,导致了ECM的降解减少,从而参与了糖尿病小鼠肾损害的发病过程。3 megsin siRNA和吡格列酮可下调糖尿病小鼠肾组织或系膜细胞megsin基因的表达,通过抑制ERK通路转导或促进基质金属蛋白酶合成,使ECM的合成减少和降解增加,从而延缓了ECM积聚的病理过程,为人类早期糖尿病肾病的防治提供了新的思路和理论依据。
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