植物源杀虫物质鬼臼毒素的酶免疫分析及环境安全性研究

论文题目: 植物源杀虫物质鬼臼毒素的酶免疫分析及环境安全性研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 农药学

作者: 徐敦明

导师: 张兴

关键词: 砂地柏,鬼臼毒素,半抗原,酶免疫分析,高效液相色谱分析,环境安全性

文献来源: 西北农林科技大学

发表年度: 2005

论文摘要: 砂地柏(Sabina vulgaris Ant.)中杀虫活性物质对昆虫表现出多种作用方式,如胃毒、拒食、熏蒸、抑制生长发育及抑制种群形成等,其主要杀虫活性成分鬼臼毒素对多种害虫表现出生物活性,且作用方式多样、作用机理特殊。西北农林科技大学无公害农药研究服务中心,在对杀虫植物砂地柏进行系统研究的基础上,研制开发出新型植物源杀虫剂--0.75%鬼臼毒素乳油。本文以鬼臼毒素制品为研究对象,在对砂地柏杀虫活性物质鬼臼毒素分析方法研究的基础上,对其环境行为和环境安全性等进行了系统研究,得到如下主要研究结果:　1. 采用不同的路线成功地合成了鬼臼毒素的人工抗原。通过2 种不同路线成功地合成了半抗原4-O(单) 琥珀酰鬼臼毒素;利用混合酸酐法(MAR)和碳二亚胺法(EDC)对半抗原与载体蛋白进行偶联,紫外扫描和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳证明成功地合成了免疫和包被所需的人工抗原。人工抗原的偶联比因载体蛋白和合成方法的不同而有所不同,Hapten-BSA1(MAR法)是88.6,Hapten-BSA2(EDC 法)是40.3,Hapten-OVA1(EDC 法)是17.8,和Hapten-OVA2(MAR 法)是54.2。2. 分别以Hapten-BSA1 和Hapten-BSA2 作为免疫原免疫新西兰大白兔,获得了两套抗鬼臼毒素的特异性抗体,并成功地建立了基于多克隆抗体的鬼臼毒素酶免疫分析技术。以混合酸酐法合成的Hapten-BSA1 作为免疫原,得效价为1/256,000 的血清M4440;以碳二亚胺法合成的Hapten-BSA2 作为免疫原,得效价为1/56,000 的血清M4469。经方阵点滴和间接非竞争ELISA 确定了血清M4440 和M4469 的工作浓度,抗血清M4440的ELISA的工作浓度:包被原稀释度为1/4,000(Hapten-OVA1,0.26μg/mL),血清稀释度为1/15,000;抗血清M4469 的ELISA的工作浓度:包被原为1/1,500(Hapten-OVA2,1.43 μg/mL),血清为1/9,000。用血清M4440 建立的IC-ELISA,对鬼臼毒素的半数抑制浓度(IC50)为2.2136 μg /mL,最低检测浓度为0.1209 μg/mL,检测范围为0.2501-19.5942 μg/mL。用血清M4469 建立的IC-ELISA,对鬼臼毒素的半数抑制浓度( IC50)为0.7897 μg/mL,最低检测浓度为0.0056 μg/mL,检测范围为0.0194-32.11670 μg/mL。建立的鬼臼毒素IC-ELISA分析方法与表鬼臼毒素、4-甲基表鬼臼毒素、脱氧鬼臼毒素有一定的交叉反应,与依泊托甙、苦鬼臼毒素、鬼臼毒素酰肼等的交叉反应率低。　3. 通过对流动相配比、流速、色谱柱等条件进行优化,确定了鬼臼毒素的HPLC分析条件:色谱柱LichrospherC18, dp5μm, 4.6mmID*25cm;流动相甲醇:水(65: 35,V/V);流速1.0mL/min;进样量5μL;检测波长290nm;鬼臼毒素的保留时间在5.7min。在蒸馏水和土壤中进行添加回收试验,添加浓度在0.1-10μg/mL 间,测得其回收率分别在

论文目录:

摘要

Abstract

第一章文献综述

1.1 砂地柏杀虫活性物质鬼臼毒素研究进展

1.1.1 砂地柏化学成分研究概况

1.1.2 砂地柏杀虫活性物质研究

1.1.2.1 砂地柏粗提物及单体的杀虫活性

1.1.2.2 砂地柏杀虫活性物质的致毒症状及作用机制

1.1.3 鬼臼毒素及其类似物研究应用现状

1.1.3.1 鬼臼毒素及类似物医用研究进展

1.1.3.2 鬼臼毒素及类似物农用研究进展

1.2 农药环境安全性评价

1.2.1 新农药登记

1.2.2 农药环境安全性评价指标

1.2.2.1 必备资料

1.2.2.2 基础资料

1.2.2.3 附加资料

1.2.3 农药环境安全评价试验程序

1.2.4 农药对环境安全性评价试验准则

1.2.4.1 环境行为特征评价试验准则

1.2.4.2 农药对非靶生物毒性试验准则

1.3 农药残留分析技术研究进展

1.3.1 农药残留分析样品前处理技术新进展

1.3.2 农药残留分析检测技术新进展

1.3.3 农药小分子免疫分析技术及其在农药残留分析中的应用

1.3.3.1 农药酶免疫分析的原理

1.3.3.2 农药酶免疫分析的程序

1.3.3.3 农药酶免疫分析在农药残留分析中的应用

1.4 本研究的提出

1.5 本研究的主要内容及技术路线

第一篇鬼臼毒素分析方法研究

第二章鬼臼毒素半抗原的合成与鉴定

2.1 材料与方法

2.1.1 试验试剂

2.1.2 试验仪器

2.1.3 透析袋的准备

2.1.4 试验方法

2.1.4.1 半抗原的合成

2.1.4.2 鬼臼毒素人工抗原的合成

2.1.5 鬼臼毒素人工抗原的鉴定

2.1.6 半抗原偶联物浓度的计算

2.1.7 半抗原与载体结合比的估算

2.2 结果与分析

2.2.1 鬼臼毒素半抗原分子结构的鉴定

2.2.2 鬼臼毒素人工抗原的鉴定

2.2.2.1 紫外扫描法鉴定鬼臼毒素人工抗原

2.2.2.2 SDS-PAGE 法鉴定鬼臼毒素人工抗原

2.2.3 半抗原与载体的结合比

2.3 讨论

附2-1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法

第三章鬼臼毒素多克隆抗体的制备与鉴定

3.1 材料与方法

3.1.1 试验试剂

3.1.2 试验仪器

3.1.3 抗原乳剂的制备

3.1.4 免疫方法

3.1.5 抗血清的分离与纯化

3.1.6 抗体的鉴定

3.1.6.1 抗体工作浓度的确定

3.1.6.2 抗体效价的测定

3.2 结果与分析

3.2.1 抗血清效价的监测

3.2.2 抗血清及包被原工作浓度的确定

3.2.3 M4440 和M4469 兔子的抗体效价

3.3 讨论

第四章鬼臼毒素间接竞争ELISA的建立

4.1 材料与方法

4.1.1 试验试剂

4.1.2 试验仪器

4.1.3 间接竞争ELISA(IC-ELISA)

4.1.4 IC-ELISA 分析条件的优化

4.1.4.1 有机溶剂对IC-ELISA分析的影响

4.1.4.2 Na+离子强度对IC-ELISA 分析的影响

4.1.4.3 pH 值对IC-ELISA 分析的影响

4.1.5 IC-ELISA 敏感度的测定

4.1.6 IC-ELISA 特异性分析

4.1.7 蒸馏水中鬼臼毒素的分析

4.2 结果与分析

4.2.1 有机溶剂对IC-ELISA 分析的影响

4.2.2 离子强度对IC-ELISA 分析的影响

4.2.3 pH 值对IC-ELISA 分析的影响

4.2.4 鬼臼毒素的标准抑制曲线

4.2.5 抗体特异性分析

4.2.6 蒸馏水中鬼臼毒素的分析

4.3 讨论

第五章鬼臼毒素高效液相色谱(HPLC)分析方法研究

5.1 材料与方法

5.1.1 试验试剂

5.1.2 供试样品

5.1.3 仪器及色谱工作条件

5.1.4 标准工作液的配制

5.1.5 添加回收率的测定

5.1.6 样品处理

5.1.7 测定步骤

5.1.8 自来水中的鬼臼毒素IC-ELISA和HPLC分析

5.2 结果与分析

5.2.1 色谱条件的确定

5.2.2 分析方法的线性相关测定

5.2.3 分析方法的精密度测定

5.2.4 分析方法的准确度测定

5.2.4.1 水样测定

5.2.4.2 土壤样测定

5.2.4.3 鬼臼毒素乳油样品含量分析

5.2.5 自来水中的鬼臼毒素IC-ELISA和HPLC分析

5.3 讨论

第二篇鬼臼毒素环境安全性研究

第六章鬼臼毒素在水体中的降解

6.1 材料与方法

6.1.1 试验试剂

6.1.2 供试水体

6.1.3 仪器设备

6.1.4 水解试验

6.1.5 间接竞争ELISA(IC-ELISA)

6.1.6 HPLC 测定

6.1.7 标准曲线

6.1.7.1 ELISA 分析

6.1.7.2 HPLC 分析

6.1.8 添加回收率试验

6.1.9 水解半衰期的计算

6.2 结果与分析

6.2.1 标准曲线

6.2.2 添加回收率

6.2.3 降解动态

6.2.3.1 ELISA 法

6.2.3.2 HPLC 法

6.2.4 ELISA 法和HPLC 法测定鬼臼毒素水解结果比较

6.3 讨论

第七章鬼臼毒素在土壤中的降解

7.1 材料与方法

7.1.1 试验试剂

7.1.2 供试土壤

7.1.3 仪器设备

7.1.4 土壤降解试验

7.1.5 间接竞争ELISA(IC-ELISA)

7.1.6 HPLC 测定

7.1.7 标准曲线

7.1.7.1 ELISA 分析

7.1.7.2 HPLC 分析

7.1.8 添加回收率试验

7.1.9 土壤降解半衰期的计算

7.1.9 农药在土壤中残留性等级划分标准

7.2 结果与分析

7.2.1 标准曲线

7.2.2 添加回收率

7.2.3 降解动态

7.2.3.1 ELISA 法

7.2.3.2 HPLC 法

7.2.4 ELISA 法和HPLC 法测定鬼臼毒素土壤降解结果比较

7.3 讨论

第八章鬼臼毒素的光化学降解

8.1 材料与方法

8.1.1 药剂及试剂

8.1.2 光源

8.1.3 仪器设备

8.1.4 供试水的配制

8.1.5 光解反应试验

8.1.6 HPLC 测定

8.1.7 标准曲线

7.1.8 光解半衰期及光解率的计算

8.2 结果与分析

8.2.1 标准曲线的建立

8.2.2 鬼臼毒素在有机溶剂中的光解动态

8.2.3 鬼臼毒素在不同pH 值水中的光解动态

8.2.4 不同光源下鬼臼毒素光解速度的比较

8.2.4.1 不同光源下鬼臼毒素在有机溶剂中的光解

8.2.4.2 不同光源下鬼臼毒素在不同pH 值水中的光解

8.3 讨论

第九章鬼臼毒素对非靶标生物的毒性

9.1 材料与方法

9.1.1 供试生物

9.1.2 试验试剂

9.1.3 试验仪器

9.1.4 试验方法

9.1.4.1 鱼毒性试验

9.1.4.2 蝌蚪毒性试验

9.1.4.3 鹌鹑毒性试验

9.1.4.4 家蚕毒性试验

9.1.4.5 蜜蜂毒性试验

9.1.4.6 蚯蚓毒性试验

9.1.4.7 瓢虫毒性试验

9.2 结果与分析

9.2.1 鬼臼毒素制品对鱼毒性

9.2.1.1 鬼臼毒素制品对鱼的毒性

9.2.1.2 鬼臼毒素制品对鱼的安全性

9.2.2 鬼臼毒素制品对蝌蚪毒性

9.2.3 鬼臼毒素制品对鹌鹑毒性

9.2.3.1 鬼臼毒素制品急性经口毒性

9.2.3.2 鬼臼毒素制品的蓄积毒性

9.2.4 鬼臼毒素制品对家蚕毒性

9.2.5 鬼臼毒素制品对蜜蜂毒性

9.2.6 鬼臼毒素制品对蚯蚓毒性

9.2.7 鬼臼毒素制品对瓢虫毒性

9.3 讨论

第十章鬼臼毒素对十字花科蔬菜的影响

10.1 材料与方法

10.1.1 试剂和仪器

10.1.2 供试植物

10.1.3 样品前处理

10.1.4 试验测定方法

10.1.4.1 光合速率测定

10.1.4.2 叶绿素含量的测定

10.1.4.3 可溶性蛋白的测定

10.1.4.4 可溶性糖的测定

10.1.4.5 过氧化物酶(POD)活性的测定

10.1.4.6 过氧化氢酶(CAT)活性测定

10.1.4.7 超氧化物岐化酶(SOD)活性测定

10.1.4.8 丙二醛(MDA)含量测定

10.1.4.9 谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)活性测定

10.2 结果与分析

10.2.1 鬼臼乳油对蔬菜上海青光合作用的影响

10.2.2 鬼臼乳油对蔬菜上海青叶绿素含量的影响

10.2.3 鬼臼乳油对蔬菜上海青可溶性蛋白的影响

10.2.4 鬼臼乳油对蔬菜上海青可溶性糖的影响

10.2.5 鬼臼乳油对蔬菜上海青SOD 活性的影响

10.2.6 鬼臼乳油对蔬菜上海青CAT 活性的影响

10.2.7 鬼臼乳油对蔬菜上海青POD 活性的响

10.2.8 鬼臼乳油对蔬菜上海青GSHPx 活性的响

10.2.9 鬼臼乳油对蔬菜上海青MDA含量的影响

10.3 讨论

附10-1 植物生理指标测定方法

第十一章总结

11.1 鬼臼毒素分析方法

11.2 鬼臼毒素的环境行为

11.3 鬼臼毒素对环境非靶标生物的毒性

11.4 鬼臼毒素对保护作物的影响

致谢

参考文献

附录

附录1 ELISA相关试剂的配制

附录2 术语和缩略语表

附录3 作者简介

发布时间: 2005-12-22

植物源杀虫物质鬼臼毒素的酶免疫分析及环境安全性研究

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