一、结直肠癌微血管密度与生物学行为及预后相关性研究（论文文献综述）
宫文静[1]（2021）在《ILT4调控非小细胞肺癌血管生成的作用和机制研究》文中研究说明研究背景在所有恶性肿瘤中,肺癌的发病率和死亡率均位居首位。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）是肺癌最主要的类型,占全部肺癌的80-85%。NSCLC起病隐匿,多数患者就诊时已处于疾病中晚期。近年来随着手术、化疗、放疗、靶向治疗及免疫治疗等多种治疗手段的发展,NSCLC的预后有了很大改善,但其整体5年生存率仍仅有20%,而复发和转移是NSCLC治疗失败的最主要因素。众所周知,肿瘤的生长和转移依赖新生血管的形成来提供能量及转移路径,因此抗血管生成治疗成为NSCLC整体治疗重要组成部分。目前临床中抗肿瘤血管生成的治疗策略主要包括:针对VEGF/VEGFR通路的大分子单克隆抗体、多靶点小分子酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor,TKI）类药物和血管内皮抑制素等。但由于肿瘤微环境中促血管生成旁路信号的激活、抗体结合力降低等原因,导致现有的抗血管生成药物的临床获益普遍较为短暂;此外,多靶点抗血管生成药物因其作用机制复杂,毒性反应较重,也在某种程度上限制了其临床应用。因此,探索NSCLC血管生成的分子机制,寻找新的有效治疗靶点,开发更具特异性的高效低毒的抗血管生成药物,是克服肿瘤血行转移、提高临床获益的重要研究方向,对提高NSCLC的治疗水平、改善患者预后具有重要意义。免疫球蛋白样转录子（immunoglobulin-like transcripts,ILTs）,也被称为白细胞免疫球蛋白样受体（leukocyte immunoglobulin-like receptors,LIR or LILR）,或单核细胞/巨噬细胞免疫球蛋白样受体（monocyte/macrophage immunoglobulin-like receptors,MIR）。根据胞内基序的作用不同分别将ILTs（LILRs）分为激活性受体LILRA（白细胞免疫球蛋白样受体亚型A,leucocyte immunoglobulin-like receptor subfamily A）和抑制性受体 LILRB（白细胞免疫球蛋白样受体亚型 B,leucocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B）。激活性受体LILRA包括LILRA1-LILRA6这6种受体;而抑制性受体LILRB包括LILRB1-5这5种受体。ILT4又被称为LILRB2、LIR2,单核细胞/巨噬细胞免疫球蛋白样受体10（monocyte/macrophage immunoglobulin-like 10,MIR-10）或 CD85d,是经典的免疫抑制性受体。作为I型跨膜蛋白,ILT4与不同的配体结合,通过胞内3个酪氨酸激酶抑制基序（immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs,ITIMs）传递抑制信号至胞内。ILT4起初发现主要表达于髓系细胞包括树突状细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和血小板。最近研究显示它也表达于活化的CD4+T细胞中。ILT4通过抑制树突状细胞的成熟和抗原提呈、诱导巨噬细胞和髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells,MDSCs）M2 样极化、抑制中性粒细胞的吞噬功能、促进CD4+Th2分化等方式,诱导免疫抑制的微环境。除免疫细胞外,近年来研究发现ILT4在乳腺癌、结直肠癌、子宫内膜癌、原发性肝癌和非小细胞肺癌等多种恶性肿瘤细胞也高表达,通过多种机制促进肿瘤细胞的增殖和侵袭,诱导M2样肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）募集及T细胞老化和免疫浸润。课题组前期通过基因芯片发现ILT4可以上调血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A,VEGF-A）和基质金属蛋白酶 9（matrix metalloproteinase 9,MMP9）这两种促血管生成因子的表达。VEGF-A是血管内皮细胞强有力的促细胞分裂剂,是调控血管生成的经典因子;MMP9也被证实能够促进血管基底膜的分解,诱导内皮细胞迁移,促进新生血管形成。因此我们推测ILT4可能与调控肿瘤新生血管密切相关。由于目前国内外针对ILT4在肿瘤新生血管形成方面的研究尚属空白,考虑到目前NSCLC抗血管生成治疗的局限性,以及我们课题组前期基因芯片的发现,本研究拟从组织水平、细胞水平以及大数据分析进行一系列研究检测ILT4对NSCLC血管生成的作用,并通过体外和体内干预性研究对可能的分子机制进行进一步的探索。该研究结果可能会为ILT4在NSCLC抗血管生成方面的研究带来新的突破。研究目的1.通过免疫组化、qPCR和Western blot检测NSCLC组织和细胞株中ILT4的表达,结合生存随访和GEO（Gene Expression Omnibus）数据库的生存信息,明确ILT4在NSCLC中的表达及预后意义;2.通过检测NSCLC组织中微血管密度（microvascular density,MVD）以及体外研究通过上调和沉默ILT4表达检测ILT4对血管内皮细胞迁移和小管生成的影响,结合数据库分析,明确ILT4对血管生成的作用;3.通过转染过表达、敲低ILT4,检测ILT4调控的促血管生成因子的变化、信号通路蛋白的变化及应用相应的促血管生成因子中和抗体、信号通路抑制剂进行干预,探究ILT4调控血管生成的分子机制;4.利用ILT4过表达/敲除肺癌细胞系建立裸鼠体内移植瘤模型,进一步体内验证ILT4对血管生成的影响及可能的分子机制。研究方法1.通过qPCR和Western blot方法检测NSCLC细胞和正常支气管上皮细胞中ILT4表达,明确ILT4在NSCLC细胞和正常支气管上皮细胞表达的差异,并筛选出内源性低表达ILT4的细胞系H1650、A549和内源性高表达ILT4的细胞系H1299、H1975。2.通过免疫组织化学方法检测ILT4在NSCLC组织和癌旁组织表达的差异,分析ILT4的表达与NSCLC临床病理指标的相关性;随访病人的生存状况,应用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,分析ILT4对NSCLC患者总生存的影响;同时结合Kaplan-Meier Plotter在线生存分析系统,分析ILT4表达对肺癌患者预后的影响。3.应用免疫组化的方法检测NSCLC组织中ILT4表达与肿瘤微血管密度相关蛋白的表达情况,同时结合 GEPIA（gene expression profiling interactive analysis）数据库,统计分析ILT4与微血管密度的相关性,ILT4/CD34共表达与临床病理参数的相关性。4.采用转染技术,将携带ILT4过表达载体的慢病毒转染内源性ILT4低表达的H1650、A549细胞株,上调H1650、A549细胞中的ILT4的表达,空载体作为对照;将携带ILT4短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）慢病毒转染内源性ILT4过表达的H1975、H1299细胞株,以下调ILT4的表达,空载体作为对照。收集该细胞培养基作为条件培养基,用于培养人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelia cells,HUVECs）。应用 qPCR 和 Western blot实验方法验证转染效果。采用Transwell细胞迁移实验和HUVECs小管形成实验检测ILT4过表达及敲除对血管内皮细胞迁移能力和小管形成能力的影响。5.通过基因芯片技术发现ILT4上调后可引起促血管生成因子VEGF-A和MMP9表达的上调。细胞水平上,通过转染技术上调和下调NSCLC细胞ILT4的表达,利用qPCR和Western blot技术验证ILT4对VEGF-A和MMP9表达的调节作用;组织水平上,通过将NSCLC组织连续切片应用免疫组化验证ILT4与VEGF-A、MMP9在组织中表达的相关性。6.采用转染技术,将内源性低表达ILT4的细胞系H1650和A549过表达ILT4,采用VEGF-A中和抗体或MMP9中和抗体进行干预,收集条件培养基,应用Transwell细胞迁移实验和HUVECs小管形成实验观察条件培养基对血管内皮细胞迁移能力和成管能力的影响。7.结合基因微阵列筛选出ILT4调控的信号通路,采用转染技术过表达和沉默NSCLC细胞ILT4的表达,利用Western blot技术检测ILT4对促分裂素原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号通路中关键蛋白及其磷酸化水平的影响,包括pERK、ERK、pp38、p38、pJNK和JNK。8.将内源性低表达ILT4的细胞系H1650和A549过表达ILT4后,加入ERK抑制剂、p38抑制剂进行干预,分别阻断ERK信号通路,p38信号通路,应用Western blot方法检测通路抑制后VEGF-A和MMP9的表达情况,采用Transwell细胞迁移实验和小管形成实验观察ERK信号通路在ILT4调控血管生成方面的作用。9.通过慢病毒感染建立稳定ILT4过表达的NSCLC细胞株A549 LV-ILT4和对照组细胞株A549 LV-NC;建立稳定干扰ILT4的NSCLC细胞株H1299 LV-shILT4和对照组细胞株H1299 LV-shNC,选择BALB/c Nude裸鼠皮下注射上述细胞,体内实验观察ILT4对NSCLC细胞体内成瘤能力的影响;利用免疫组化的方法检测移植瘤组织中微血管密度,同时检测促血管生成因子VEGF-A、MMP9和信号通路ERK和pERK蛋白表达,进一步验证ILT4对血管生成能力的影响。研究结果1.ILT4在NSCLC细胞系和NSCLC肿瘤组织中高表达qPCR和Western blot检测显示ILT4在NSCLC细胞中的表达高于正常支气管上皮细胞。内源性低表达ILT4的细胞系为H1650和A549,内源性高表达ILT4的细胞系为H1299和H1975。免疫组化显示ILT4在NSCLC肿瘤组织中的表达高于肿瘤周围正常组织,ILT4在肿瘤组织的阳性表达率为:57.7%（52/90）,在周围正常组织中的阳性率为4.4%（4/90）。2.ILT4表达与NSCLC患者临床病理指标及患者预后的相关性ILT4在NSCLC肿瘤组织中的表达与较晚的TNM分期（III期-IV期,p=0.0104）,淋巴结转移（p=0.001）成正相关。随访90例NSCLC患者生存,Kaplan-Meier生存分析显示ILT4高表达患者的OS低于ILT4低表达患者OS（p=0.0419）。利用Kaplan-Meier Plotter在线生存分析系统分析ILT4对肺癌患者预后的影响,采用包含ILT4基因特定序列的探针进行测探,探针207697xat信息显示ILT4高表达组患者总生存OS（p=0.056）及中位至疾病进展时间FP均低于ILT4低表达组（p=0.022）。3.ILT4表达水平与NSCLC瘤内微血管密度的相关性,ILT4/CD34共表达与临床病理指标的相关性目前尚没有ILT4在NSCLC血管生成方面的研究,我们探索性的分析了ILT4表达水平与NSCLC肿瘤组织中的微血管密度的相关性。采用临床常用的CD34阳性的细胞表达情况代表微血管密度。GEPIA数据库分析提示,ILT4与CD34表达呈正相关;组织标本免疫组化结果提示ILT4高表达组的微血管密度显着高于ILT4低表达组的微血管密度（p=0.0058）。同时ILT4+/CD34+共表达患者,较ILT4-/CD34-组患者,有更高的淋巴结转移率（p=0.0466）,共表达组腺癌的患者比例明显增高（p=0.0 12）。4.ILT4促进HUVECs细胞迁移能力和HUVECs小管形成能力Transwell细胞迁移实验证实过表达ILT4的H1650和A549的条件培养基促进HUVECs细胞迁移,并提高其成管能力;ILT4下调的H1975和H1299的条件培养基抑制HUVECs的细胞迁移,减弱其成管能力。5.ILT4可以上调NSCLC中促血管生成因子VEGF-A和MMP9的表达基因芯片检测提示肿瘤细胞ILT4过表达可引起VEGF-A和MMP9基因表达上调。在细胞水平上,通过qPCR和Western blot结果提示过表达ILT4后的NSCLC细胞系VEGF-A和MMP9的RNA水平和蛋白水平均明显升高;下调ILT4表达后的NSCLC细胞系VEGF-A和MMP9的RNA水平和蛋白水平均显着下降;组织水平上,在病理连续切片中通过免疫组化提示ILT4高表达组织中VEGF-A、MMP9的蛋白表达水平偏高。6.ILT4通过调控NSCLC细胞的VEGF-A、MMP9表达参与血管内皮细胞迁移和HUVECs小管形成内源性低表达ILT4的H1650和A549细胞系过表达ILT4后,加入VEGF-A中和抗体或MMP9中和抗体进行干预,收集条件培养基,培养HUVECs,结果示阻断VEGF-A、MMP9表达后,HUVECs细胞迁移能力明显降低;HUVECs的小管形成能力明显下降。7.ILT4可以激活NSCLC细胞ERK、p38信号通路基因微阵列分析提示上调ILT4后可引起MAPK信号通路中多种基因的表达。MAPK信号通路主要包括ERK通路,JNK通路和p38信号通路。Western blot实验提示H1650和A549细胞过表达ILT4后,肿瘤细胞的pERK、pp38水平升高,H1975和H1299细胞下调ILT4表达后,pERK,pp38蛋白表达水平均明显降低。8.ILT4通过激活ERK信号通路促进VEGF-A、MMP9表达将内源性低表达ILT4的H1650、A549细胞过表达ILT4后,加入ERK抑制剂U0126和p38通路抑制剂SB 203580（20μM）进行干预,培养48小时,收集条件培养基,Western blot提示加入ERK抑制剂U0126后ILT4过表达上调的VEGF-A、MMP9表达被显着逆转,加入p38通路抑制剂对VEGF-A、MMP9表达无影响。9.ILT4通过ERK信号通路调控血管内皮迁移和HUVECs的小管形成Transwell迁移实验和HUVECs小管形成实验证实抑制ERK信号通路后,ILT4上调的血管内皮细胞迁移能力和成管能力均显着逆转。结果提示:ILT4通过ERK信号通路诱导VEGF-A、MMP9表达并调控血管内皮细胞迁移和HUVECs的小管形成。10.ILT4促进NSCLC细胞体内成瘤及血管生成通过裸鼠皮下注射稳定过表达ILT4的NSCLC细胞株A549 LV-ILT4,和注射稳定干扰ILT4表达的细胞株H1299 LV-shILT4,建立裸鼠移植瘤模型,结果提示ILT4过表达组,NSCLC肿瘤生长速度显着快于对照组,ILT4过表达组的肿瘤体积和重量明显大于对照组;干扰ILT4表达组,肿瘤生长速度显着慢于对照组,ILT4干扰组的肿瘤体积和重量明显小于对照组。通过建立裸鼠移植瘤模型,造模4周后,分离肿瘤组织行免疫组化,结果提示ILT4过表达组,肿瘤微血管密度显着高于对照组,VEGF-A和MMP9表达高于对照组,pERK明显高于对照组,ERK表达无明显改变;干扰ILT4表达后,肿瘤微血管密度显着低于对照组,VEGF-A和MMP9表达低于对照组,pERK明显低于对照组,ERK表达无明显改变。体内实验进一步支持ILT4具有促进NSCLC血管生成的潜力。结论1.ILT4在NSCLC组织中及多个NSCLC细胞株中高表达,与更晚的病理分期、淋巴结转移及临床不良预后明显相关,可作为预后预测因子。体内体外实验证实ILT4可促进NSCLC血管生成。2.体外实验证实了 ILT4通过激活ERK信号通路上调VEGF-A、MMP9的表达并促进NSCLC血管内皮细胞迁移和小管形成,体内实验进一步验证了 ILT4对NSCLC血管生成的作用及潜在机制。
王一同[2]（2021）在《华蟾素注射液治疗结肠癌腹水的优效人群分析及对VM的作用机制研究》文中指出研究背景恶性腹水是晚期结肠癌患者的常见并发症,是临床治疗的难点。西医目前主要采用腹腔穿刺置管引流、全身化疗或联合腹腔灌注化疗等方法,但恶性腹水患者多为肿瘤晚期,经过多程放、化疗治疗,体质较差,再次化疗的敏感性及耐受性降低,且恶性腹水多为血性,无法大量置管引流,使腹胀、喘憋等症状持续存在,严重影响生活质量。因此需探索更为温和、有效的治疗方法。中药腹腔灌注,可避免口服汤药引起的胃肠不适,副反应小,近年来广泛应用于恶性腹水的临床治疗。本团队致力于华蟾素注射液腔内灌注治疗研究多年,发现华蟾素注射液对恶性浆膜腔积液有一定的疗效,庄等研究发现,华蟾素注射液腔内灌注治疗恶性浆膜腔积液,有效率为66.42%;杨等研究发现,华蟾素注射液腔内灌注对于恶性胸水有效率为60.00%;袁等研究发现,华蟾素注射液对于消化系统肿瘤来源恶性腹水有效率为75.4%,疗效更好,但前期研究对于不同癌种患者分层后病例数较少,未进行具体分层讨论。恶性腹水的生成与血管新生密切相关。本团队前期基础研究发现华蟾素注射液能够降低恶性腹水中的红细胞数量,使腹水颜色变浅,推测华蟾素注射液可能通过抑制肿瘤血管新生干预恶性腹水的生成。血管生成拟态（Vasculogenic Mimicry,VM）是近年来提出的全新肿瘤血管新生模式,可能与传统内皮细胞参与的肿瘤血管新生共同促进恶性腹水的生成。既往多数研究关注在华蟾素对内皮细胞参与的肿瘤血管新生的影响,鲜有研究探究华蟾素对VM形成的影响。研究目的临床部分:明确华蟾素注射液腹腔灌注治疗对于结肠癌这一单一病种来源的恶性腹水的疗效及该治疗方法对应的优效人群特征,以期为华蟾素注射液腹腔灌注治疗结肠癌恶性腹水提供更为个体化的临床指导。实验部分:由临床现象探索内在机制。以VM为新切入点,通过体内、体外实验观察华蟾素注射液对结肠癌HCT116细胞VM形成的影响及作用机制,从而更为全面地从肿瘤血管新生角度阐述华蟾素注射液腹腔灌注抑制结肠癌恶性腹水的作用机制。研究方法临床部分:采用单臂回顾性研究方法,收集2010年1月1日～2020年12月31日于北京中医药大学东方医院肿瘤科行华蟾素注射液腹腔灌注治疗的结肠癌恶性腹水的患者临床资料,从腹水量控制率、腹水质改善率、KPS评分改善情况及患者生存期方面进行疗效评价,同时评价安全性。进一步对比不同因素（如肿瘤原发病特点、转移情况、整体及局部中医辨证分型、合并全身治疗等）对疗效的影响,从中筛选优效病例,总结优效人群特征。实验部分:（1）采用结肠癌HCT116细胞腹腔+脾脏原位接种法建立BALB/C裸鼠结肠癌血性腹水模型;观察造模前后及华蟾素注射液干预前后裸鼠一般体征、体重、腹围、腹水量、腹水红细胞数量及腹腔转移瘤瘤重等。（2）采用CoCl2化学诱导建立结肠癌HCT116细胞体外缺氧模型;采用CCK-8实验、细胞划痕实验、Transwell实验检测缺氧微环境及华蟾素注射液对结肠癌HCT116细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响。（3）采用Matrigel基质胶细胞三维培养建立结肠癌HCT116细胞体外VM模型;通过PAS-CD31组织化学与免疫组化双染法显示结肠癌HCT116细胞体内VM的形成;显微镜下计数VM形成数目,观察缺氧微环境及华蟾素注射液对结肠癌HCT116细胞体内、体外VM形成的影响。（4）采用RT-qPCR、Western-blot实验检测缺氧微环境及华蟾素注射液对结肠癌 HCT116 细胞 VM 形成相关靶点 HIF-1α、VEGF、MMP2、MMP9、VE-cadherin mRNA及蛋白表达的影响。研究结果临床部分:（1）腹水量疗效评价:研究共纳入135例患者。灌注后腹围较灌注前显着减小（P<0.01）;完全缓解2例,部分缓解25例,稳定56例,合计有效83例,无效52例,总有效率61.5%。（2）腹水质疗效评价:灌注后腹水红细胞数、腹水肿瘤标记物、腹水乳酸脱氢酶水平较灌注前显着下降（P<0.01）;腹水红细胞较治疗前下降≥25%者94例,总有效率74.0%;腹水肿瘤标记物较灌注前下降≥25%者70例,总有效率55.1%,其中CEA、CA199、CA724水平下降显着,铁蛋白水平较灌注前差异无统计学意义（P>0.05）;腹水乳酸脱氢酶较治疗前下降≥25%者50例,总有效率39.4%。（3）KPS评分疗效评价:灌注后KPS评分较灌注前显着提高（P<0.01）;较治疗前提高者41例,较治疗前稳定者82例,较治疗前减少者12例。（4）生存情况疗效评价:纳入患者截至末次随访,仍存活者2例,腹水生存期为1～31个月,平均腹水生存期5.66±4.59个月,中位腹水生存期4.00个月;腹水1年生存率为9.6%,2年生存率为3.7%,未见大于3年生存者。（5）安全性评价:出现不良反应者27例,占比20.0%,主要不良反应为腹痛（10例）、发热（11例）、恶心呕吐（3例）、腹泻（3例）,多可耐受或对症治疗后可较快缓解,为1级轻度不良反应。未见由药物引起的骨髓抑制、肝、肾功能异常及心电图改变,未见腹腔感染、肠梗阻、消化道出血等严重并发症,安全性良好。（6）短期疗效优效人群特征分析:对于男性、有饮酒史、左半结肠、灌注前血液NLR≤2.81、初诊即诊断恶性腹水、血性腹水、全身辨证含瘀毒证,全身辨证非肝肾阴虚证、局部辨证为湿热毒证及合并全身中医治疗患者的腹水量控制方面疗效更好,其中结肠癌位置、腹水性质、合并全身中医治疗是影响腹水量控制率的独立预后因素;对于有饮酒史、无肝转移、有腹腔淋巴结转移、无胆红素升高、血性腹水、局部辨证为湿热毒证及合并全身中医治疗患者的腹水颜色改善方面疗效更好,其中肝转移、胆红素升高、腹水性质、局部辨证为影响腹水颜色改善率的独立预后因素。（7）长期疗效优效人群特征分析:有家族史、左半结肠、无肝转移、无脑转移、转移部位≤2个、灌注前无血中乳酸脱氢酶升高、初诊即诊断恶性腹水、全身辨证非肝肾阴虚证、无不良反应及腹水量得到控制的患者腹水生存期更长,但与外部研究结果对比生存期未见明显延长。实验部分:（1）结肠癌HCT116细胞腹腔+脾脏原位接种可建立较为稳定的BALB/C裸鼠结肠癌血性腹水模型;Matrigel基质胶细胞三维培养可建立结肠癌HCT116细胞体外VM模型。（2）华蟾素注射液腹腔注射可抑制结肠癌血性腹水的生成、降低腹水中红细胞数目,抑制结肠癌腹腔转移瘤的生成。（3）缺氧微环境可促进结肠癌HCT116细胞迁移、侵袭,增强体外VM的形成能力。（4）华蟾素注射液可逆转缺氧对HCT116细胞造成的不良影响,抑制其增殖、迁移、侵袭及体内、体外VM的形成。（5）缺氧微环境可上调HCT116细胞HIF-1α、VEGF、MMP2、MMP9、VE-cadherin mRNA及蛋白的表达,华蟾素注射液干预后可抑制HIF-1α、VEGF、MMP2、VE-cadherinmRNA及蛋白表达,对MMP9 mRNA及蛋白未见显着影响。研究结论临床部分:（1）华蟾素注射液腹腔灌注可有效抑制结肠癌恶性腹水的产生,延缓病情进展,降低腹水中的红细胞数量,提高KPS评分,改善患者生活质量,安全性良好;（2）左半结肠癌、无肝转移、无胆红素升高、血性腹水、局部辨证为湿热毒证及合并全身中医治疗的患者是华蟾素注射液腹腔灌注治疗的优效人群,通过人群特征初步筛选后用药可提高临床疗效。实验研究:华蟾素注射液腹腔灌注抑制结肠癌血性腹水的机制,可能与其逆转肿瘤缺氧微环境,下调HIF-1α、VEGF、MMP2、VE-cadherin mRNA及蛋白的表达从而抑制结肠癌细胞体内、体外VM的形成,同时抑制结肠癌细胞增殖、迁移及腹腔侵袭有关。
张凯[3]（2021）在《一、伴微血管侵犯肝细胞癌患者根治术后早期复发预测模型的建立、验证与评价 二、结直肠癌肝转移转录组特征及其免疫微环境与预后的相关性研究》文中研究说明目的:根治性切除术是肝细胞肝癌患者获得治愈的主要局部治疗手段。如患者术后病理提示其伴有微血管侵犯则易出现早期复发。本文的目的为构建伴微血管侵犯肝细胞肝癌患者术后早期复发的预测模型并对其进行评价。材料与方法:收集2014年1月至2019年6月在中国医学科学院肿瘤医院肝胆外科因肝细胞癌行根治性手术且术后病理证实肿瘤伴有微血管侵犯患者的资料。首先利用单因素及多因素Cox分析确定复发独立危险因素,然后利用逻辑回归模型鉴定早期复发独立危险因素。应用早期复发独立危险因素构建预测模型并以列线图及网页计算器形式展示。我们后续对比了预测模型与AJCC第八版分期及BCLC分期在区分度、校准度及临床实用性方面的价值。区分度采用C指数指标;准确性应用校准曲线评价;临床实用性评估则通过绘制临床决策曲线进行评价。最后,我们根据约登指数分别计算出预测模型、AJCC第八版分期及BCLC分期在预测患者早期复发的最佳阈值点。根据此阈值点重新构建混淆矩阵,然后利用新的混淆矩阵对比三者的灵敏度、特异度及准确率。结果:最终纳入406例患者,其中早期复发组160例,非早期复发组246例。将所有纳入患者以7比3的比例随机分为建模组及验证组。预测模型参数的筛选及多因素逻辑回归方程的构建均应用建模组数据。首先,通过Cox分析确定患者复发的独立危险因素。后续以是否早期复发为结局变量,以上述Cox分析筛选出的复发独立危险因素为自变量,鉴定早期复发独立危险因素。结合既往学者的研究,最终确定术前AFP水平、术前HBeAg状态、MVI分组、肿瘤最大径、肿瘤个数、肝被膜侵犯及卫星结节是患者术后早期复发的独立危险因素。应用上述7个因素构建预测模型,结果以列线图及网页计算器形式展示。区分度方面,预测模型的C指数无论在建模组还是验证组均优于AJCC第八版分期及BCLC分期（建模组:预测模型vs AJCC 8th vs BCLC 为 0.74 vs 0.60 vs 0.57;验证组:预测模型 vs AJCC 8th vs BCLC为0.74 vs 0.63 vs 0.6）。校准度评价方面,采用Bootstrap法分别在建模及验证组中对样本进行1000次重抽样并绘制校准曲线,结果显示无论是在建模组还是验证组中预测概率均能与实际概率有较好的吻合,模型能准确预测患者的早期复发。决策曲线分析（DCA）显示预测模型有较好的临床实用价值。根据约登指数计算预测模型评分的最佳截断值为120分。根据此截断值将患者分为早期复发的高危组及低危组,在建模组及验证组中具有较好的灵敏度及特异度（灵敏度:建模组及验证组:74%,76%;特异度:建模组及验证组:61%,64%）。结论:伴微血管侵犯的肝细胞肝癌患者在行肝癌切除术后,其术后具有较高的早期复发风险。MVI分组、HBeAg状态、术前血AFP水平、肿瘤个数、肿瘤直径、卫星结节及肝被膜侵犯是此类患者术后早期复发的独立危险因素。应用上述因素构建的预测模型能准确预测伴微血管侵犯肝细胞癌患者术后的早期复发。背景及目的:以手术为主的综合治疗是同时性结直肠癌肝转移患者获得NED状态的主要治疗手段。但是患者术后仍有较高复发率。传统的基于临床及病理特征的分期系统尚不能准确评估患者预后。随着高通量测序技术的进步及生物信息学的发展,临床医生已能快速准确高效地获得患者的基因组及转录组信息。基于基因组数据的新分期及分型系统已应用于临床并显示出了良好的预后及疗效预测价值。但是,对于同时性结直肠癌肝转移患者的转录组学特征、预后相关分子分型及免疫微环境的研究较少。因此,为能综合评价患者的原发灶及肝转移灶的表达谱及免疫微环境特点,寻找患者预后的影响因素,本研究对同时性结直肠癌肝转移患者的原发灶及肝转移灶进行了转录组测序并进行了基于表达谱数据的免疫微环境分析。材料与方法:本研究收集了 20例同时性结直肠癌肝转移患者的标本及相关临床病理资料。对采集到的每位患者的结直肠癌原发灶、肝转移灶及配对的正常结直肠及肝组织进行了普通转录组测序。经上游数据分析后获得每例样本的表达谱数据。后续我们分别对比鉴定了结直肠癌原发灶VS正常结直肠组织、结直肠癌原发灶VS肝转移灶、肝转移灶VS正常肝组织的差异表达基因并进行了富集分析。考虑到组织特异性表达谱可能影响分析结果,在进行原发灶VS转移灶的对比分析中我们删除了肝或结直肠的组织特异性基因集。免疫微环境方面,我们用6种算法计算出结直肠癌原发灶及肝转移肿瘤微环境中不同细胞的比例或丰度;同时我们还计算了ESTIMATE评分、免疫分型及CMS分型（共识分子分型,一种基于表达谱数据对结直肠癌肿瘤的分子分型系统）以整体评估患者的免疫微环境状态及表达谱特征。最后,联合患者的临床病理资料及上述生物信息学结果,我们进行了综合分析并筛选了影响患者预后的可能因素。结果:1.在进行组织间差异基因分析时,我们发现组织间PCA结果、肝转移灶VS正常肝组织差异基因分析结果及结直肠癌原发灶VS肝转移灶差异基因分析结果均显示出各类标本表达谱的组织特异性。2.我们利用TSGS方法对比分析了肝转移灶VS结直肠癌原发灶的差异基因。经富集分析发现,结直肠癌肝转移灶相对于结直肠癌原发灶其EMT能力下降,MYC相关通路可能增强。3.在利用ESTIMATE算法整体评估每个肿瘤样本的基质评分、免疫评分及肿瘤纯度时,我们发现部分样本的肿瘤纯度较低。联合CMS分型结果,我们发现CMS4型标本的免疫评分及基质评分均显着高于其他亚型,其依据ESTIMATE算法计算出的肿瘤纯度较低。因此,我们认为CMS4型的低肿瘤纯度为其间质浸润型表达谱特征的一种反应。后续分析发现,无论原发灶还是转移灶,高ESTIMATE总分及低肿瘤纯度为患者预后的危险因素。4.CMS2型在结直肠癌原发灶及转移灶中均占据主导地位。肝转移灶无CMS3型。我们认为其可能是由于肝脏中较高的代谢表达谱特点掩盖了 CMS3代谢障碍的表达谱特点导致。此点后续需进一步深入研究。肝转移灶的CMS分型与患者的预后相关,肝转移灶的CMS 2型及4型的预后好于1型及3型。结直肠癌原发灶的免疫分型与患者的预后相关,免疫分型1型好于2型。5.无论结直肠癌原发灶还是肝转移灶中,多种算法均显示肿瘤微环境中浸润中性粒细胞比例升高与患者的不良预后有关。结论:1.结直肠癌肝转移灶保留了其原发部位正常结直肠组织的表达谱特征,在进行相关对比分析时需加以矫正。2.结直肠癌肝转移灶相对于结直肠癌原发灶,其EMT能力下降,MYC相关通路可能增强。3.无论结直肠癌原发灶或转移灶,CMS4型表达谱均具有明显的间质浸润特点,其应用ESTIMAT法评估的免疫评分及基质评分均显着高于其他亚型,基于ESTIMATE法可能无法准确评估此亚型肿瘤的纯度。对于结直肠癌,ESTIMATE法的评分及其计算出的肿瘤纯度仅为其表达谱的一种特征。4.结直肠癌原发灶免疫分型及肝转移CMS分型与患者预后相关。5.结直肠癌原发灶及转移灶中肿瘤微环境中浸润中性粒细胞比例升高与患者的不良预后有关。
张彦收[4]（2021）在《LRG1在乳腺癌中表达的临床意义及其对乳腺癌细胞生物学行为的影响》文中指出乳腺癌是威胁女性健康最常见的恶性肿瘤之一,其发病率逐年上升。世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）发布的2020年全球最新癌症数据显示,乳腺癌新发病例高达226万例,并已超过肺癌成为全球第一大癌症。在我国,女性恶性肿瘤发病首位同样为乳腺癌,每年发病人数约为30.4万。因此,对于乳腺癌预防、诊断和治疗的研究是目前医学领域工作的重点。当前,随着乳腺癌治疗模式的进步和新型药物的不断涌现,乳腺癌的治疗效果已取得了巨大突破。然而,乳腺癌耐药后出现的复发、转移仍然是困扰临床的难题之一。因此,研究乳腺癌的增殖、侵袭、转移机制,探寻新的治疗途径和靶点对提高乳腺癌的生存率至关重要。富亮氨酸α2糖蛋白1（leucine-rich-alpha-2-glycoprotein1,LRG1）是富亮氨酸重复序列（leucine-rich repeat,LRR）家族蛋白成员,也是最早被发现的含有LRR结构的蛋白。人LRG1基因定位于染色体19p13.3,含有2810个碱基对,包括2个外显子和1个内含子。第一个外显子含43个碱基对,第二个外显子含1737个碱基对,共编码347个氨基酸残基。前35个氨基酸残基为信号肽,312个氨基酸残基构成单个肽链。因其定位的染色体区域同时存在数个编码中性粒细胞颗粒酶的基因,并且LRG1在人类MPD和HL-60细胞嗜中性分化过程中上调,而在HL-60细胞单核细胞分化过程中下调,早期研究认为LRG1可能是中性粒细胞早期分化的一种标志物。随着分子生物学技术的不断发展,LRG1的其它功能逐渐被发现:LRG1不仅参与细胞蛋白间的相互作用,同时在细胞信号转导、细胞黏附及发育过程中也发挥着重要作用。近些年研究显示LRG1在人类多种恶性肿瘤组织、血液、脑脊液、外泌体中异常表达,并且可以作为部分肿瘤早期诊断和预后判断的生物标记物。当前研究发现,LRG1在肿瘤的发生、发展、侵袭转移、上皮间质转化和异常血管生成过程中扮演重要角色,因此,LRG1在抗肿瘤治疗领域发挥的作用逐渐被大家重视。然而,LRG1在不同肿瘤中的表达存在明显差异,提示LRG1在不同肿瘤的发生、发展中可能发挥不同作用。如外泌体中LRG1与非小细胞肺癌发生发展有关;肝癌组织中LRG1表达较正常组织下调,体外实验显示LRG1对肝癌细胞增殖没有影响;卵巢癌患者血清和肿瘤组织中LRG1表达升高程度与肿瘤分期相关。LRG1在不同肿瘤中所发挥的作用正在积极探索之中。越来越多研究提示LRG1是抗肿瘤治疗的潜在靶点。但是,LRG1在乳腺浸润性癌中的表达、临床意义及作用机制有待进一步研究。本研究分三部分对LRG1在乳腺浸润性癌中的表达及临床意义进行了研究:第一部分:通过生物信息学方法分析不同肿瘤中LRG1mRNA及蛋白的表达情况,探索其与临床病理指标及预后的关系。第二部分:通过免疫组化Max Vision TM一步法检测了330例原发性乳腺癌组织中LRG1蛋白的表达,进一步分析LRG1蛋白的表达与乳腺癌临床病理指标及预后的相关性。第三部分:应用逆转录-多聚酶链式反应（RT-PCR）技术、Western-blot技术检测不同乳腺癌细胞系中LRG1的表达情况。采用RNA干扰技术抑制乳腺癌MD-MB-231细胞LRG1基因表达,通过CCK-8实验检测细胞增殖能力;划痕实验检测转染后细胞迁移能力;Transwell实验检测细胞侵袭能力。探讨LRG1对乳腺癌细胞生物学行为的影响。第一部分LRG1在不同肿瘤中的表达及临床意义的生物信息学分析目的:通过生物信息学方法分析LRG1在不同肿瘤中的表达及其临床意义。方法:基于人类癌症基因组图谱（the cancer genome atlas,TCGA）数据库（http://www.tcga.org/）中肿瘤组织及正常组织中RNA-seq的测序结果,使用TIMER2.0在线工具（https://cistrome.shinyapps.io/timer/）分析LRG1mRNA在肿瘤组织与正常组织中的表达情况。从人类蛋白质图谱图像（the human protein atlas）数据库中（https://www.proteinatlas.org）中获取LRG1蛋白在不同肿瘤组织和正常组织中表达的情况。基于Kaplan-Meier plotter数据库（http://kmplot.com/analysis）中患者的临床特征、生存资料,分析不同肿瘤中LRG1mRNA的表达与总生存期（overall survival,OS）和无复发生存期（recurrence free survival,RFS）之间的关系,并绘制Kaplan-Meier曲线。结果:1.LRG1mRNA在乳腺浸润癌（breast invasive carcinoma,BRCA）（1097例）、肾透明细胞癌（kidney renal clear cell carcinoma,KIRC）（533例）、肺腺癌（lung adenocarcinoma,LUAD）（515例）、子宫内膜癌（uterine corpus endometrial carcinoma,UCEC）（545例）、甲状腺癌（thyroid carcinoma,THCA）（501例）中的表达量显着高于相对应的癌旁正常组织,差异具有统计学意义（P<0.001）。2.分析The Human Protein Atlas（https://www.proteinatlas.org）数据库中LRG1蛋白在BRCA、KIRC、LUAD、UCEC、THCA组织中的表达情况,结果显示LRG1蛋白在此五种癌组织中表达水平显着高于癌旁正常组织。3.分析LRG1mRNA在BRCA不同亚型中表达情况。566例Luminal型乳腺癌中LRG1表达量为37.462（9.930-74.197）,高于HER-2阳性型和三阴性乳腺癌（P<0.01）。根据淋巴结转移情况进一步分析显示,1646例淋巴结阳性患者组LRG1mRNA表达量高于2415例淋巴结阴性组,差异具有统计学意义（P<0.0001）。17例粘液腺癌中LRG1mRNA的表达量明显低于其它浸润性癌（浸润性导管癌、浸润性小叶癌及混合型癌）,差异具有统计学意义（P<0.0001）。利用Kaplan-Meier plotter在线工具,分析TCGA数据库中生存数据,LRG1mRNA的表达与Luminal A型、Luminal B型、HER-2阳性型乳腺癌的OS无明显关系（均P>0.05）,但在Basal-like亚型中,LRG1的表达与OS显着相关,LRG1表达低的乳腺癌患者OS较好（HR=3.12,95%CI=1.54-6.29,P<0.001）。4.在KIRC中,随着临床分期的升高,LRG1mRNA的表达呈上升趋势。Ⅳ期患者LRG1的表达量显着高于Ⅰ、Ⅱ期患者,差异具有显着性（P<0.01）。在不同组织学分级中,呈现同样趋势,组织学分化3级患者组LRG1表达量显着高于1、2级（P<0.01）。利用Kaplan-Meier plotter在线工具,分析TCGA数据库中530例KIRC患者的OS及RFS数据并绘制生存曲线,结果显示367例LRG1高表达组患者OS低于163例低表达组,LRG1mRNA的表达与OS显着相关（HR=1.71,95%CI=1.18-2.47,P=0.0042）。LRG1mRNA的表达与RFS关系与OS一致,LRG1高表达组患者RFS低于低表达组（HR=3.57,95%CI=1.26-9.87,P=0.0089）。在肾乳头状细胞癌（kidney renal papillary cell carcinoma,KIRP）数据中,同样发现LRG1mRNA表达水平可以预测患者OS及RFS,高表达组患者OS及RFS均差于低表达组,差异具有显着性（OS:HR=2.19,95%CI=1.2-4.01,P=0.0091;RFS:HR=5.32,95%CI=1.2-22.54,P=0.011）。5.LUAD组织中LRG1mRNA的表达量显着高于正常组织。在正常肺组织中,LRG1mRNA中位表达量为25.277（20.394-30.683）,在LUAD组织中表达量为35.431（20.538-53.567）,差异具有统计学意义（P<0.001）。分析503例肺鳞状细胞癌（lung squamous cell carcinoma,LUSC）和52例正常组织的数据,发现LRG1mRNA在正常组织中表达水平显着高于LUSC（26.701 vs 11.612,P<0.001）。LRG1mRNA在LUAD和LUSC中的表达存在明显差异。在LUAD组,222例LRG1高表达组患者OS低于282例低表达组,LRG1mRNA表达与OS显着相关（HR=1.34,95%CI=1-1.8,P=0.045）。6.LRG1mRNA在UCEC组织中表达量为24.37（10.368-48.392）,高于正常子宫内膜组织表达（10.072,2.357-14.296）,差异具有显着性（P<0.001）,LRG1mRNA在UCEC中呈现高表达,但与年龄、临床分期、月经状态及预后无显着相关性。7.LRG1mRNA在THCA中的表达量随着淋巴结转移个数的增多而升高,具有统计学意义（P=0.027）,在预后方面,261例LRG1高表达组患者OS优于241例低表达组,且具有显着性差异（HR=0.11,95%CI=0.02-0.48,P=0.00035）。结论:1.LRG1mRNA及蛋白在BRCA、KIRC、LUAD、UCEC及THCA中表达显着上调,LRG1可能在肿瘤发生发展过程中发挥重要促进作用。2.Luminal型乳腺癌中LRG1mRNA表达量高于HER-2阳性型和三阴性,LRG1与Basal-like亚型乳腺癌的OS呈负相关。3.KIRC中LRG1mRNA的表达可以预测OS及RFS,LRG1表达与OS、RFS呈负相关。4.LRG1mRNA在LUAD中表达上调,LRG1高表达提示患者OS较差。5.LRG1mRNA在UCEC中表达上调,但与临床特征及预后无显着相关性。6.LRG1mRNA在THCA中表达与淋巴结转移个数呈正相关,与OS呈显着正相关。第二部分乳腺癌组织中LRG1蛋白表达与临床特征及生存预后的关系目的:探讨乳腺癌组织LRG1蛋白的表达与乳腺癌临床特征及生存预后的关系。方法:通过免疫组化Max Vision TM一步法检测330例原发性乳腺癌组织中LRG1蛋白的表达情况,探讨LRG1与乳腺癌患者年龄、月经、肿瘤大小、临床分期、淋巴结转移状况、组织学分级、分子亚型及生存预后的相关性。结果:1.LRG1蛋白在原发性乳腺癌中表达情况。在330例原发性乳腺癌患者中,58.48%（193例）患者LRG1呈阳性表达。LRG1着色部位主要位于细胞质,阳性信号表现为褐色颗粒状外观。2.LRG1蛋白的表达与临床病理指标的关系。0-3个淋巴结转移组LRG1阳性表达128例,阴性表达121例,阳性表达率51.41%;3个以上淋巴结转移组LRG1阳性表达65例,阴性表达16例,阳性表达率80.25%,两组间LRG1阳性表达率存在显着性差异（χ2=20.939,P<0.001）。LRG1的表达与淋巴结转移负荷呈正相关,随着淋巴结转移数量的增多,LRG1的阳性表达率升高。Ⅰ-Ⅱ期患者组LRG1阳性表达124例,阴性表达125例,阳性表达率62.96%;Ⅲ期组LRG1阳性表达69例,阴性表达12例,阳性表达率85.19%。两组间LRG1阳性表达率的差异有统计学意义（χ2=31.520,P<0.001）。LRG1的表达与肿瘤负荷呈正相关,随着疾病的进展,LRG1的阳性表达率升高。3.LRG1蛋白的表达与乳腺癌DFS（disease-free survival,DFS）、OS的关系。330例患者中位随访时间72个月,92例患者出现局部复发或远处转移,80例患者死亡。LRG1阳性表达组72个月的DFS为61.14%（118/193）,阴性表达组DFS为87.59%（120/137）,两组间DFS存在显着差异（χ2=27.123,P<0.001）。72个月OS与DFS结果相似,共出现80例死亡事件,总体人群72个月OS为75.76%。LRG1阳性表达组72个月的OS为66.32%（128/193）;LRG1阴性组为89.05%（122/137）,两组间差异有显着性（χ2=22.864,P<0.001）。4.影响DFS及OS的COX回归模型多因素分析COX多因素分析显示LRG1表达、TNM病理分期和分子亚型是影响乳腺癌患者DFS和OS的独立危险因素（P<0.05）。肿瘤大小、组织学分级、年龄、月经状态与DFS、OS无显着相关性（P>0.05）。LRG1表达、TNM病理分期和分子亚型对DFS的风险比分别为2.090、3.214和1.796;对于OS的风险比分别是2.112、2.628和1.755。结论:1.乳腺癌LRG1蛋白的表达与年龄、月经状态、肿瘤大小、组织学分级、分子亚型无关。2.乳腺癌LRG1蛋白的表达与淋巴结转移个数呈正相关,随着淋巴结转移个数的增多,LRG1的阳性表达显着升高。3.乳腺癌LRG1蛋白的表达与病理TNM分期相关,分期越晚,LRG1的阳性表达越高。4.LRG1蛋白的表达、TNM病理分期和分子亚型是影响乳腺癌DFS、OS的独立危险因素。LRG1表达水平与DFS、OS呈负相关。第三部分LRG1在乳腺癌细胞中的表达及其对乳腺癌细胞生物学行为的影响目的:验证乳腺癌细胞系中LRG1的表达是否与乳腺癌组织中表达一致,为LRG1在乳腺癌发生、发展及侵袭转移中的作用提供理论支持。方法:主要应用了RNA干扰技术、RT-PCR、Western-blot技术和细胞划痕实验等方法,观察不同乳腺癌细胞系中LRG1的表达情况,抑制LRG1表达后细胞的增殖、迁移、侵袭能力的变化。结果:1.RT-PCR方法检测乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7及SK-BR-3细胞中LRG1mRNA的表达。在三种不同乳腺癌细胞（MDA-MB-231、MCF-7及SK-BR-3）中,LRG1mRNA表达水平差别显着,具有统计学意义（P<0.05）。MCF-7细胞中LRG1mRNA的相对表达量（0.1260±0.0070）,较MDA-MB-231细胞（0.1103±0.0081）、SK-BR-3细胞（0.0703±0.0027）相对表达量显着增高。2.MDA-MB-231、MCF-7及SK-BR-3细胞中LRG1蛋白的表达。在三种不同乳腺癌细胞MDA-MB-231、MCF-7及SK-BR-3中,LRG1蛋白的表达存在显着差别,具有统计学意义（P<0.05）。MCF-7细胞中LRG1蛋白相对表达水平最高（10.9510±0.6721）,显着高于MDA-MB-231（7.8492±0.1327）、SK-BR-3细胞（4.3906±0.1914）。3.采用RNA干扰技术抑制乳腺癌MD-MB-231细胞LRG1基因表达。Western-blot技术检测检测转染成功后MDA-MB-231细胞中LRG1蛋白的表达,结果显示,转染组（MDA-MB-231-Si）中LRG1蛋白表达量（0.4105±0.1906）较对照组细胞（MDA-MB-231）中的表达量（0.8295±0.1295）明显降低,差异具有显着性（P<0.05）。4.CCK-8实验检测细胞增殖能力。转染成功后,CCK-8实验检测各组细胞在24h、48h、72h和96h后450 nm处OD值。结果显示:随着时间的延长,转染组（MDA-MB-231-Si）增殖率明显低于转染阴性对照组（MDA-MB-231-NC）及对照组（MDA-MB-231）,提示LRG1表达抑制后,细胞增殖能力下降。5.细胞划痕实验检测细胞迁移能力。划痕实验分别检测处于对数生长期的对照组、转染阴性对照组、转染组细胞（MDA-MB-231、MDA-MB-231-NC及MDA-MB-231-Si）细胞的迁移能力。划痕0小时测得的划痕区面积:对照组细胞（MDA-MB-231）、转染组细胞（MDA-MB-231-Si）、转染阴性对照组细胞（MDA-MB-231-NC）分别为:15.054±0.122,14.679±0.142,13.407±0.112。划痕24小时后测得的划痕区面积分别为:6.714±0.131,9.559±0.122,5.217±0.132。面积缩小的比值依次为:55.40%,34.88%,61.08%。乳腺癌MDA-MB-231-Si细胞在划痕24小时后的迁移率均明显低于对照组（MDA-MB-231）、转染阴性对照组（MDA-MB-231-NC）,差异有显着性（P<0.05）。6.Transwell实验检测细胞侵袭能力。Transwell侵袭实验显示转染组（MDA-MB-231-Si）穿膜细胞数少于转染阴性对照组（MDA-MB-231-NC）及对照组（MDA-MB-231）,提示LRG1表达抑制后,细胞侵袭能力下降。结论:1.MCF-7细胞中LRG1mRNA的相对表达量,较MDA-MB-231细胞、SK-BR-3细胞相对表达量显着增高。2.MCF-7细胞中LRG1蛋白的相对表达水平较MDA-MB-231细胞、SK-BR-3细胞显着增高。3.si-RNA干扰LRG1表达后可减弱MDA-MB-231细胞的增殖、迁移及侵袭能力。
王婷婷[5]（2020）在《非小细胞肺癌YAP1和SRPX2的表达与微血管密度及预后的相关性研究》文中进行了进一步梳理目的:探讨YAP1和SRPX2在非小细胞肺癌组织中表达与微血管密度（Microvessel density,MVD）及预后的关系。方法:采用蛋白免疫印迹法检测20例NSCLC及其癌旁组织中YAP1和SRPX2的表达,采用免疫组织化学方法检测80例NSCLC及其28例癌旁组织中YAP1、SRPX2和MVD的表达情况,分析YAP1、SRPX2和MVD表达的相关性及与患者临床病理特征的关系。采用Kaplan-Meier生存曲线分析YAP1和SRPX2表达水平与NSCLC患者预后的关系。结果:蛋白免疫印迹结果显示YAP1和SRPX2在NSCLC组织中的表达均高于癌旁组织（P<0.05）;免疫表型显示YAP1和SRPX2在NSCLC组织中均阳性表达,阳性表达率分别为62.5%（50/80）和55%（44/80）,YAP1和SRPX2在癌旁组织中的表达率分别为7.14%（2/28）和0;YAP1和SRPX2的表达与NSCLC患者性别、年龄、吸烟、病理类型、分化程度不相关（P>0.05）,与患者的肿瘤TNM分期、淋巴结转移情况相关（P<0.05）;MVD的表达与NSCLC患者年龄、吸烟、病理类型不相关（P>0.05）,与患者的肿瘤分化程度、TNM分期、淋巴结转移情况相关（P<0.05）;YAP1和SRPX2阳性表达组的MVD值高于阴性组（P<0.05）;NSCLC组织中YAP1和SRPX2表达水平呈现正相关（r=0.545,P<0.05）,且YAP1和SRPX2表达与MVD值呈正相关;生存分析显示,YAP1和SRPX2阳性表达组生存期明显低于阴性表达组。结论:YAP1和SRPX2在NSCLC组织中的表达具有相关性,两者可能参与到NSCLC的血管生成机制,进而促进NSCLC的生长、侵袭和转移,可能为NSCLC患者提供新的预测指标和治疗靶点。
曾英[6]（2020）在《胶质母细胞瘤临床和分子病理学特征及NTSR1促其增殖的分子机制研究》文中研究指明胶质母细胞瘤是成人常见的恶性程度最高的脑肿瘤,预后差。目前,采用手术、新辅助化疗、电场治疗使胶质母细胞瘤患者的预后有所改善,中位生存期延长至20.5个月。因此迫切需要开发新的治疗靶点,而针对有效的治疗取决于我们对其增殖和侵袭机制的认识,因此探讨胶质母细胞瘤增殖、侵袭的机制仍然是目前研究的热点和难点。中枢神经系统肿瘤世界卫生组织（World Health Organization,WHO）分类（第四版修订版）收录了胶质母细胞瘤的少见的亚型,如上皮样胶质母细胞瘤（epithelioid glioblastoma,E-GBM）,并根据异柠檬酸脱氢酶（Isocitrate dehydrogenase,IDH）基因是否突变将胶质母细胞瘤分为IDH野生型胶质母细胞瘤（glioblastoma IDH wide-type,GBM IDH-wt）和IDH突变型胶质母细胞瘤（glioblastoma IDH-mutant,GBM IDH-mut）。E-GBM少见,不同文献对其预后报道不一致,因此,E-GBM的临床病理特征值得进一步研究。同样,大多数文献报道GBM IDH-mut预后显着好于GBM IDH-wt患者,然而亦有少数文献报道部分GBM IDH-mut进展迅速,预后差,因此,GBM IDH-wt的临床病理特征仍值得探讨。我们从498例胶质母细胞瘤中选取具有完整病理资料的胶质母细胞瘤138例,其中有15例E-GBM,并从165例有IDH1免疫组化检测结果的胶质母细胞瘤中发现10例GBM IDH-mut,我们进一步对二者进行了临床病理回顾性分析,对少见类型的胶质母细胞瘤的临床病理特点和预后相关因素进行总结和探讨。神经降压素（neurotensin,NTS）作为一种在中枢和外周神经系统广泛表达的神经肽,主要通过神经降压素受体1（neurotensin receptor1,NTSR1）介导激活下游信号通路。NTS/NTSR1信号促进胶质瘤增殖、迁移和侵袭。NTS/NTSR1信号能激活Wnt信号通路。NTSR1是连接β-catenin/Tcf转录复合体的Wnt/APC癌基因信号通路的直接靶位,另有研究发现NTS也是Wnt/β-catenin信号通路的直接靶位,探讨NTSR1与胶质母细胞瘤临床及分子亚型关系以及NTSR1与Wnt/β-catenin信号通路的关系,不仅有助于阐明胶质母细胞瘤增殖的分子机制,也为胶质母细胞瘤的诊断和个性化治疗提供新靶点和新策略。因此,本课题共分为以下两个部分:第一部分,对138例胶质母细胞瘤进行临床资料总结和组织学观察,并行免疫组织化学染色检测IDH1、ATRX、P53、EGFR、PTEN、CD44和CHI3L1的表达,对其进行分子分型及预后相关性分析;对10例GBM IDH1-mut和15例E-GBM进行临床病理回顾性研究,随机选取15例non E-GBM作为对照,进行组织病理学观察和EnVision法免疫组织化学染色,分子病理检测,对预后因素进行分析,旨在明确胶质母细胞瘤的临床病理特点和预后相关因素。第二部分,探讨NTSR1促进胶质母细胞瘤生长的分子机制,首先在胶质母细胞瘤组织样本中检测NTSR1的表达,分析NTSR1表达与胶质母细胞瘤分子分型、重要分子标志IDH1、ATRX、P53表达的相关性及预后进行分析,发现NTSR1表达的患者较NTSR1阴性的患者预后差。在A172和U87细胞系中敲低NTSR1表达及过表达NTSR1,评估NTS/NTSR1对Wnt/β-Catenin信号的调控效应,并在动物模型中进行验证,进一步研究NTS/NTSR1对Wnt/β-Catenin信号的调节机制以及Wnt/β-catenin信号是否参与调节NTSR1表达,最后评估靶向NTSR1/Wnt/β-catenin环路的治疗潜能。主要实验结果及结论如下:第一部分结果1.临床特点:1.1胶质母细胞瘤（n=138）患者平均年龄61.4岁,中位年龄53岁,男性74例,女性64例,男:女之比1.16:1。幕上好发,幕下罕见,额叶、颞叶好发,约26.08%的患者累及2叶;以头昏头痛、呕吐等为主要症状,23.19%的患者复发,中位PFS 6.0个月。中位OS 9.0个月,平均OS 15.6个月。1.2 E-GBM患者15例,占同一时期胶质母细胞瘤（n=498）的3.0%,男性12例,女性3例,平均年龄39.6岁,中位年龄34岁,14例累及幕上,以头昏、头痛为主要症状,1例有胶质瘤病史;non E-GBM患者15例,男性11例,女性4例,平均年龄57.3岁,中位年龄63岁,15例累及幕上,以头昏、头痛为主要症状,1例有胶质瘤病史。二者中位年龄差异有统计学意义（p=0.002）。二者性别（p=1.000）、中位OS（p=0.079）差异无统计学意义。1.3 IDH1突变型GBM患者10例,占同一时期胶质母细胞瘤（n=165）的6.1%,男性6例,女性4例,平均年龄44.6岁,7例累及额叶,以头昏、头痛为主要症状,5例有胶质瘤病史。2.组织病理学:GBM IDH1-mut和nonE-GBM的共同形态学特征为细胞多形性,异型明显,核分裂像易见,可见微血管增生及不同程度的栅栏状坏死和凝固性缺血性坏死。E-GBM形态表现为较为一致的上皮样细胞及横纹肌样细胞,异型明显,核分裂像易见,微血管增生,以地图样凝固性缺血性坏死为主。根据坏死累及范围分为大片和局灶。3.免疫组化特点:3.1 138例GBM中IDH1阳性9例,EGFR弥漫表达46例,CHI3L1阳性66例,ATRX缺失27例,P53阳性52例。3.2 10例GBM IDH1-mut中GFAP、Nestin、IDH1均呈阳性表达,Olig-2可见不同程度表达（9/10）,P53呈弥漫阳性表达（9/10）;ATRX缺失。3.3 15例E-GBM GFAP在9例中呈阳性表达,6例中局灶阳性,Vimentin、Nestin、S-100、c-Met、INI1、ATRX在15例中均阳性表达,P53在7例中阳性表达;6例中EMA、EGFR局灶阳性,4例中CHI3L1局灶阳性。E-GBM（6/15）局部表达EGFR,non E-GBM（10/15）弥漫表达EGFR。E-GBM（86.7%,13/15）表达EZH2,E-GBM（60.0%,9/15）过表达EZH2;Non E-GBM（86.7%,13/15）表达EZH2,Non E-GBM（53.3%,8/15）过表达EZH2,EZH2过表达率二者差异无统计学意义（p=0.713）。4.分子特点:4.1 138例胶质母细胞瘤分子分型结果如下:间叶型66例,经典型46例,前神经元9例,其他/不能分类17例。4.2一代测序法（Sanger测序法）显示10例GBM IDH1-mut均见IDH1R132H突变,15例E-GBM均未见IDH1R132H突变,15例nonE-GBM中见1例IDH1R132H突变;二者差异无统计学意义（p=1.000）。4.3 MS-PCR显示（9/10）GBM IDH1-mut MGMT启动子发生甲基化,46.7%（7/15）E-GBM MGMT启动子发生甲基化;53.3%（8/15）nonE-GBM MGMT启动子发生甲基化,二者差异无统计学意义（p=0.715）。4.4实时荧光定量PCR示GBMI IDH1-mut（0/3）BRAFV600E无突变,E-GBM（46.7%,7/15）BRAFV600E突变,non E-GBM（0/15）BRAFV600E无突变;二者在BRAF突变率（p=0.01）差异有统计学意义。4.5 FISH显示GBM IDH1-mut（0/3）1p/19q无缺失,15例E-GBM 1p/19q无缺失,non E-GBM（1/15）1p/19q缺失,二者差异无统计学意义（p=1.000）;15例E-GBM EGFR无扩增。5.预后分析5.1 Kaplan-Meier曲线分析显示性别（p=0.823）、P53（p=0.093）与OS无显着统计学相关性,单因素Cox回归分析显示年龄（p=0.007）、IDH1突变状态（p=0.013）、ATRX突变状态（p=0.023）、分子分型（p=0.019）、治疗方式（p=0.000）与OS有显着统计学相关性,多因素Cox回归分析显示分子分型（p=0.008）、治疗方式（p=0.000）与OS有显着统计学相关性。5.2 E-GBM患者OS（≤12个月）的6例表现为广泛坏死（6/6）,过表达EZH2（6/6）,MGMT启动子未发生甲基化（5/6）,BRAFV600E突变（3/6）,治疗方式（仅手术,4/6）;E-GBM患者OS（>12个月）的3例E-GBM表现为局部坏死（3/3）,EZH2低表达和阴性（3/3）,MGMT启动子甲基化（2/3）,BRAFV600E突变（0/3）,治疗方式（手术+放疗/放化疗,2/3）。5.3 GBM IDH1-mut患者预后分析:4例预后差的患者均血管增生显着,平均密度19.9/20HPF,坏死范围广泛,4例患者其中3例累及两叶,治疗方式为仅手术或手术+化疗;5例预后好的患者肿瘤内血管增生不密集,平均密度10.1/20HPF,局灶坏死,其中4例均累及单叶,其中长期存活的3例的治疗方式为手术+放化疗。第一部分结论:1.胶质母细胞瘤患者OS与胶质母细胞瘤分子分型、重要分子标志IDH1、ATRX的突变状态、治疗方式相关,分子亚型、治疗方式是胶质母细胞瘤的独立预后因素。2.E-GBM少见,预后差。广泛坏死,MGMT启动子未甲基化,EZH2过表达和缺乏辅助放化疗均提示E-GBM预后不良。3.GBM IDH1-mut少见,肿瘤累及范围、坏死范围和微血管增生密度、治疗方式均是GBM IDH1-mut患者的预后因素。第二部分结果1.138例GBM中NTSR1阳性80例,NTSR1在GBM分子亚型中表达差异有显着统计学意义（p=0.003）,在经典型、间叶型的阳性率分别是67.4%、63.6%,前神经元型和不能确定亚型分别是11.1%和35.3%。NTSR1与IDH1表达呈显着统计学负相关（p=0.001）,NTSR1与ATRX表达呈显着统计学正相关（p=0.043）;NTSR1与P53表达无显着统计学相关（P=0.263）;Kaplan-Meier曲线分析显示NTSR1表达与中位OS统计学负相关（p=0.008）,单因素Cox分析显示NTSR1表达较NTSR1阴性预后差。2.降低NTSR1表达和使用NTSR1的药物性抑制剂SR48692处理A172和U87细胞系,Wnt/β-Catenin信号活性显着降低和Wnt/β-Catenin信号下游靶位（MYC、CCND1和MMP7）的mRNA表达降低,NF-κB和MAPK磷酸化水平显着降低;在NF-κB抑制剂（TPCA-1）和MAPK抑制剂（U0126）作用下,Wnts表达水平降低;U251细胞过表达NTSR1,Wnt/β-Catenin信号活性显着增加和Wnt/β-Catenin下游靶位表达水平增加;使用Wnt有效的活化剂（Wnt3a）刺激,NTSR1 m RNA和NTSR1蛋白水平增加,在Wnt抑制剂iCRT3作用下,NTSR1m RNA和NTSR1蛋白水平降低（p<0.05）。3.体外实验使用NTS或Wnt3a能显着上调A172和U87细胞增殖率和降低凋亡,使用SR48692或iCRT3联合处理细胞,使NTS和Wnt3a的增殖效应减弱和凋亡增加（p<0.01）。4.NOD-SCID BALB/c小鼠皮下移植瘤实验示SR48692或i CRT3处理组,肿瘤生长率受到显着抑制。SR48692和i CRT3肿瘤抑制生长,伴随增殖标记Ki67指数的降低（p<0.05）。第二部分结论1.NTSR1表达与胶质母细胞瘤分子亚型有关。NTSR1表达是胶质母细胞瘤预后差的因素。2.在胶质母细胞瘤中NTS/NTSR1通过上调NF-κB和MAPK信号的表达,增加Wnt/β-Catenin信号通路活性;NTSR1受Wnt/β-catenin信号调节,NTS/NTSR1和Wnt/β-catenin信号之间存在正反馈环路;靶向抑制NTSR1/Wnt/β-catenin环路,胶质母细胞瘤细胞生长受到明显抑制。
李鑫[7]（2020）在《CD34、D2-40和VEGF在结直肠癌中的表达及其与临床相关病理学特征的关系》文中研究表明目的本课题通过检测新生脉管特异性标志物CD34、D2-40和VEGF在结直肠癌组织中的表达,探讨CD34、D2-40和VEGF与临床相关病理学特征之间的关系,明确其在结直肠癌临床病理精准分期的意义。方法收集2016年1月-2018年9月间于宁夏医科大学总医院行手术治疗的768例结直肠癌患者临床病例资料,依据纳入、排除标准筛选出549例患者临床资料及术后病理组织标本。统计分析CD34、D2-40和VEGF与结直肠癌临床相关病理学特征的关系以及CD34、D2-40、VEGF三者之间相关性。结果1 CD34阳性表达率与CRC浸润深度、淋巴结转移情况、TNM分期密切相关（P<0.05）,与年龄、性别、肿瘤部位、大小、分化程度、远处转移无关（P>0.05）。2 D2-40阳性表达率与CRC浸润深度、淋巴结转移情况、TNM分期密切相关（P<0.05）,与年龄、性别、肿瘤部位、大小、分化程度、远处转移无关（P>0.05）。3 VEGF阳性表达率与CRC淋巴结转移情况、TNM分期密切相关（P<0.05）,与CRC浸润深度、年龄、性别、肿瘤部位、大小、分化程度、远处转移无关（P>0.05）。4 CD34、D2-40和VEGF三者阳性表达率在CRC中有显着相关性（P<0.05）。结论CD34、D2-40、VEGF在CRC组织中的表达与CRC临床相关病理学特征密切相关,可望为结直肠癌临床病理精准分期提供相关的理论依据。
彭滔[8]（2019）在《GATA6/LOXL2复合体以及MACC1促进胆管癌血管生成的机制研究》文中认为研究背景:胆管癌（CCA）是仅次于肝细胞癌的第二常见肝胆系统肿瘤,预后差,其总体发病率在世界范围内呈上升趋势。对于早期CCA患者,手术切除是首选的治疗方案,但只有部分患者（约35%）适合于具有疗效的外科切除。因此,更好地深入了解CCA的分子特征和生物学行为将有助于寻找新的分子靶点治疗CCA。血管生成是由已有的血管系统形成新的血管过程,已成为恶性肿瘤的一个公认标志。肿瘤通过生成的血管提供营养和氧气维持迅速的生长和转移。血管内皮生长因子A（VEGFA）在肿瘤血管生成中起着关键作用,并与许多实体癌的肿瘤血管密度有关。高微血管密度（MVD）的实体瘤患者比低微血管密度的实体瘤患者生存期短。抗血管生成治疗已被临床应用于各种实体瘤,包括CCA。尽管如此,抗血管生成治疗对癌症的临床疗效仍不令人满意,而且临床副作用、细胞毒性、耐药和患者复发率均较高。因此,迫切需要理解血管生成的新机制。GATA结合蛋白6（GATA6）是GATA结合蛋白家族的一员,包含两个高度保守的含锌指转录因子。在胚胎发育期间GATA6对心血管系统、消化系统和其他组织的增殖、分化和发育至关重要。肿瘤发生与胚胎期基因激活密切相关,GATA6的过度表达可促进胃癌、结直肠癌、乳腺癌以及胆管癌的进展。一些研究表明GATA6与肿瘤血管生成有关,但其分子机制尚未研究。赖氨酰氧化酶样蛋白2（LOXL2）是细胞外基质（ECM）修饰酶LOX家族的成员,其家族包括原型LOX和四种不同的LOX样蛋白（LOXL1、LOXL2、LOXL3和LOXL4）。LOXL2的C端区域负责其酶活性,N端包含四个富含半胱氨酸结构域的清道夫受体（SRCR）,这些区域被认为与蛋白质-蛋白质相互作用有关。已有研究表明,核内LOXL2可与某些转录因子协同调节上皮间质转换（EMT）,促进肿瘤转移。此外,靶向抑制LOXL2可降低肿瘤和眼科疾病的血管生成。然而,在CCA中LOXL2的血管生成机制尚未研究。结肠癌转移相关基因1（MACC1）在2009年首次通过全基因组在人类结肠癌组织和转移组织中搜索差异表达的基因而被发现。既往已有报道,MACC1 mRNA表达可能是结直肠癌、肺腺癌、胰腺癌、肝门部胆管癌复发及无病生存的独立预后指标。MACC1通过肝细胞生长因子（HGF）/c-Met/MAPK信号通路促进癌细胞的增殖、迁移和侵袭性。先前的研究表明MACC1参与胃癌和宫颈癌的血管生成。然而,MACC1与CCA中血管生成的相关性尚未被研究。在我们的第一部分研究中,我们使用生物信息学分析表明GATA6可能与VEGFA的启动子区域结合。我们证实了GATA6转录调控了VEGFA的表达,并阐明了一种新的CCA血管生成机制,LOXL2与GATA6结合,上调VEGFA的表达,促进血管生成和肿瘤生长。在第二部分研究中,我们也发现CCA中MACC1和VEGFA显着上调,并且MACC1和VEGFA表达水平呈正相关,我们进一步证实了MACC1调控VEGFA的表达和分泌,促进了CCA细胞的血管生成。研究方法:第一部分1.分析TCGA和GEO数据库中GATA6和LOXL2的mRNA表达,以及与VEGFA的相关性。2.收集2013年至2016年西南医院手术切除91例CCA和31例癌旁患者的样本。这些患者术前或术后均未接受放疗或化疗。通过中国芯超公司将91例癌组织和31例癌旁石蜡样品组织制作成组织芯片（TMA）,采用免疫组化方法分析GATA6、LOXL2、VEGFA和MVD（CD34）在TMA上的表达水平。3.采用Kaplan-Meier曲线和Cox回归分析GATA6/LOXL2表达与总生存率和无病生存率之间的相关性。在TMA中分析了GATA6/LOXL2表达与VEGFA表达和MVD的相关性。4.实时定量qPCR和Western Blotting检测干预GATA6和LOXL2表达后对VEGFA的影响。用激光共聚焦扫描显微镜检测GATA6和LOXL2在胆管癌细胞的共定位。采用免疫共沉淀法（Co-IP）分析了GATA6与LOXL2的相互作用。采用双荧光素酶报告基因和染色质免疫沉淀法（ChIP）分析了GATA6与LOXL2转录激活VEGFA。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测VEGFA的分泌水平。通过基质胶血管形成实验检测对血管生成的影响。5.我们构建了两个缺失或保留SRCR结构域的LOXL2缺失突变体（Flag-LOXL2-Δ1:删除氨基酸548-774;Flag-LOXL2-Δ2:删除氨基酸1-547）和全长LOXL2（Flag-LOXL2-full）,以进一步探讨LOXL2和GATA6之间的相互作用位点。Co-IP实验检测不同的LOXL2突变体与GATA6的相互作用,并用双荧光素酶报告基因检测不同的LOXL2突变体对VEGFA启动子活性影响。6.我们利用裸鼠皮下肿瘤进一步验证GATA6/LOXL2复合体对VEGFA的调控及对血管生成、肿瘤生长的影响。通过手术切除皮下肿瘤,然后进行测量。肿瘤切片后行苏木精-伊红（HE）和IHC染色。第二部分1.TCGA（网址:https://cancergenome.nih.gov/）和GEO（网址:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）的数据,进入编号:GSE76297,GSE89749,数据库是免费公开下载的。比较CCA组织与正常组织间MACC1和VEGFA的mRNA表达差异,并分析MACC1与VEGFA表达的关系2.2010年至2016年在西南医院肝胆外科接受手术的122例CCA患者中,有31例癌旁组织标本。2018年手术中获得7例成对的CCA和癌旁组织,并立即保存在液氮中。所有患者均未接受新辅助化疗或肝移植。采用real-time qPCR和Western blot技术检测7对CCA中MACC1和VEGFA的表达水平。采用免疫组织化学方法（IHC）检测石蜡包埋CCA样品中MACC1、VEGFA和MVD（CD34）的表达水平。3.采用Kaplan-Meier曲线和Cox回归分析MACC1和VEGFA表达与总生存率的关系,分析MACC1表达与VEGFA表达及MVD的关系。4.采用real-time qPCR和Western blot检测干预MACC1表达对VEGFA的影响。通过共聚焦激光扫描显微镜检测MACC1和VEGFA表达的定位。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测VEGFA的分泌水平。HUVECs成管实验分析各组血管腔形成的差异。研究结果:第一部分1.数据中分析发现GATA6和LOXL2的mRNA表达在胆管癌中上调,并且与VEGFA的表达相关。2.免疫组化分析表明GATA6主要在细胞核表达,而LOXL2在细胞核和细胞质中均都表达。两种蛋白染色方法的评分只计算核内表达。在TMA中所有癌旁标本的胆管上皮GATA6、LOXL2和VEGFA染色均为阴性。在TMA中的癌组织,38例GATA6和LOXL2弱阳性或强阳性样本定义为双阳性,标记为GATA6/LOXL2阳性;28例定义为双阴性,标记为GATA6/LOXL2阴性。VEGFA表达在细胞浆中。免疫组化观察到VEGFA阳性表达（35/66）和阴性表达（31/66）。CD34在血管内皮细胞中表达并标记MVD。在38个GATA6/LOXL2阳性和28个GATA6/LOXL2阴性染色样本中,MVD的平均值（定义为截止值）为23.69/mm2。免疫组化观察到高MVD（40/66）和低MVD（26/66）。3.Kaplan-Meier分析显示,与GATA6/LOXL2阴性的CCA患者相比,GATA6/LOXL2阳性的CCA患者总生存率更差（log rank P=0.01）,无病生存率更短（log rank P=0.02）。利用Cox回归分析评估年龄、性别、肿瘤位置、TNM分期和GATA6/LOXL2表达的危险比（HRs）,我们观察到GATA6/LOXL2的表达是总生存率和无病生存率的独立预测因子（HR=1.871,95%CI=1.070-3.271,P=0.028;HR=1.781,95%CI=1.013-3.129,P=0.045）。另外,TNM期（ⅢⅣ）是总生存率和无病生存率的另一个独立预测因子（HR=2.333,95%CI=1.3114.150,P=0.004;HR=1.861,95%CI=1.0533.291,P=0.033）。在TMA中的同一样本,我们观察到38个GATA6/LOXL2阳性组织中有25个（65.8%）VEGFA阳性组织,27个（71.1%）高MVD组织。因此,GATA6/LOXL2与VEGFA（P=0.02）和MVD（P=0.04）呈正相关。4.细胞实验表明GATA6和LOXL2敲除可显着降低QBC939细胞中的VEGFA蛋白水平,GATA6和LOXL2过表达可增加RBE细胞中的VEGFA蛋白水平。在CCA细胞中也观察到相同的mRNA水平变化。共聚焦激光扫描显微镜检测表明,GATA6位于细胞核内,LOXL2位于细胞核和细胞质内。这些结果与CCA组织的IHC结果一致。免疫共沉淀实验证实了GATA6和LOXL2在CCA细胞系中相互结合,通过这种相互作用转录调节VEGFA的表达和分泌,促进了血管的形成。5.基于Co-IP实验结果,在CCA细胞中,GATA6与LOXL2的SRCR结构域结合不依赖于催化结构域。并且,Flag-LOXL2-Δ1和Flag-LOXL2-full增加了VEGFA启动子活性;然而,LOXL2-Δ2没有增加VEGFA启动子活动。此外,QBC939细胞中GATA6或LOXL2的下调降低了LOXL2与GATA6的相互作用。基于这些结果,说明LOXL2的SRCR域与GATA6相互作用,增加VEGFA启动子活性。6.体内分析进一步验证了GATA6/LOXL2可促进VEGFA的表达、血管生成和肿瘤生长。第二部分1.与正常对照组织相比,数据集中CCA组织和配对的癌旁组织中MACC1和VEGFA显着上调。在TCGA、GSE76297和GSE89749数据集中,MACC1与VEGFA显着相关。2.与癌旁组织比较,7例冰冻CCA组织中MACC1和VEGFA的蛋白和mRNA水平均升高。免疫组化显示,CCA患者中,MACC1高表达和VEGFA高表达分别为53.3%（65/122）和54.9%（67/122）。MACC1/VEGFA共同高表达43例,MACC1/VEGFA共同低表达33例。然而,所有31例癌旁组织中MACC1和VEGFA均为低表达。122例CCA患者中,高MVD 56例（45.9%）,低MVD 66例（54.1%）。3.Kaplan-Meier分析显示,MACC1和VEGFA的高表达与总生存率降低显着相关（log-rank P<0.01和P<0.05）。MACC1-高/VEGFA-高表达组的总体生存率也低于MACC1-低/VEGFA-低表达组（log-rank P<0.001）。Cox回归分析显示,MACC1和淋巴结转移是CCA患者总体生存的独立预测因子。高MACC1表达的CCA组织中有66.2%（43/65）高表达VEGFA（P<0.01）,高MACC1表达的CCA组织中有60%（39/65）高MVD。4.激光共聚焦扫描显微镜显示,MACC1和VEGFA在胞质和细胞核中均有表达。Western blotting和real-time qPCR证实敲除MACC1可显着下调两种CCA细胞系VEGFA的蛋白和mRNA表达。ELISA结果表明,MACC1敲除显着降低了VEGFA的分泌水平。HUVECs成管实验显示,在两组CCA细胞中,MACC1敲低组的条件培养基的成管数均显着低于对照组（P<0.01和P<0.01）。研究结论:总之,我们的研究证明了一种新的分子机制,即LOXL2和GATA6相互作用促进血管生成,复合体结合在VEGFA的启动子区域从而增强VEGFA的表达,促进了血管生成以及促进肿瘤生长。小分子细胞渗透性抑制剂治疗CCA以及患者分层的预后标记候选可能具有很大的价值。除此之外,我们也发现CCA中MACC1和VEGFA表达上调,而MACC1和VEGFA的高表达预示着较差的生存率,并且MACC1是一个独立的生存预测因子,通过上调VEGFA促进CCA血管生成。
董印军[9]（2019）在《18F-Alfatide PET/CT食管癌整合素受体显像及图像纹理预测价值研究》文中认为PET/CT是一种目前最先进的核医学显像技术,不仅可以直观的显示病灶位置和大小,更能够在分子层面上反映代谢、血供等深层次信息。相对于超声、X线等其他传统影像学检查,PET/CT能够更高分辨率的显示人体各部分的组织结构状况以对病变进行诊断,尤其是在肿瘤的诊断上,可以有效提示是否发生肿瘤及是否出现转移等情况。18F-FDG是目前PET/CT最常用也是最成熟的显像剂,然而其并不是肿瘤特异性显像剂。由于炎症以及某些良性肿瘤等疾病在一定程度上也可以呈现18F-FDG高代谢,从而在诊断时出现假阳性结果,并且肥胖、血糖水平和外源性胰岛素的应用也能严重影响FDG在体内的分布状况,从而影响显像的准确性,干扰临床诊断甚至带来其他严重后果。每种示踪剂都有其体内组织分布、代谢过程、显像原理的不同,造成了各个示踪剂的显像特点差异及优缺点。因此探索和研发不同的显像剂已成放射影像领域研究者和临床工作者的研究热点。目前18F-FDG虽然是最成熟的示踪剂,但随着国内外许多各类型的新型示踪剂的研制和应用,PET/CT单一示踪剂的局面已被逐渐打破,各类示踪剂研究和技术也在迅速进步和发展。肿瘤内新生血管形成能够促进肿瘤发展和向远端迁移,是肿瘤的主要特征之一。肿瘤生长及癌细胞转移的过程离不开血供,因此往往伴随着新生血管的生成,整合素αvβ3在这一过程中发挥重要作用。通过整合素αvβ3与特异性配体RGD肽的结合,通过PET可以无创地显示高表达整合素αvβ3的肿瘤组织,这种显像技术有望为肿瘤的诊断和治疗提供新线索。18F-AL-NOTA-PRGD2（简写为18F-Alfatide）是一种可以特异地识别、结合αvβ3新型的示踪剂,可以作为PET/CT检查的新的示踪剂。前期研究已证实了 18F-Alfatide在人体中的安全性及对肺良恶性病变的诊断价值,对于准确的无创肺癌的分期及预后评估有较好意义,并在食管癌患者PET/CT检查中成功显像。本实验旨在探索18F-Alfatide PET/CT对食管癌患者的诊断意义和临床应用价值,并探讨采用18F-Alfatide显像剂获取的PET/CT纹理参数对食管癌分期及分化程度等的预测价值。第一部分18F-Alfatide PET/CT在食管癌显像及其与αvβ3、VEGF表达研究目的本研究旨在探讨18F-Alfatide PET/CT对食管癌及区域淋巴结显像的诊断价值,通过免疫组化方法研究食管癌肿瘤组织的整合素αvβ3、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）和微血管密度（MVD）的表达,探讨并分析整合素αvβ3、VEGF表达水平与MVD表达的关系并分析是否存相关,另外分析αvβ3、VEGF、MVD表达与18F-Alfatide PET/CT摄取值的相关关系。从组织学与功能影像相结合的角度来探讨它们在食管癌侵袭转移中的作用,研究18F-Alfatide PET/CT参数与反映肿瘤新生血管和肿瘤浸润转移指标的关系。方法自2015年9月至2018年7月在山东省肿瘤医院就诊且病理诊断的49名胸段食管癌患者,经医院伦理委员会批准,自愿入组并签署知情同意书。在确认患者无远处转移或明确的临近组织器官侵犯后,最终32人行18F-Alfatide PET/CT检查并行食管癌切除及系统的淋巴结清扫术,分别记录每名患者的肿瘤及各组淋巴结标准摄取值（standardized uptake value,SUV）和血液、肌肉摄取值计算比率（Tumour-to-blood/muscle ratio）。收集患者完整的临床资料,将其切除肿瘤和癌旁组织进行石蜡包埋。参考病理诊断结果并进行对比研究。采用免疫组织化学法检测石蜡组织连续切片中avβ3、VEGF和MVD的表达,将免疫组化结果同18F-Alfatide PET/CT病灶的摄取值（SUVmax、SUVavg）对照分析明确其关联关系。结果1.49人完成18F-Alfatide PET/CT,行根治性手术治疗32人,通过组织病理诊断3 1例鳞状细胞癌,1例肉瘤样癌。所有接受检查的患者均未出现示踪剂药物相关反应或检查不良反应。2.18F-Alfatide PET/CT对食管癌原发灶可以清晰显像,周围正常组织有较低的放射性摄取。探测入组患者食管癌原发灶的敏感性、特异性和准确性均为100%。食管原发灶最大摄取值SUVmax、平均摄取值SUVavg及靶比本值SUVPT/Bl、SUVPT/MU在性别和肿瘤TNM分期及分化程度上差异均无统计学意义（P≥0.05）。3.18F-Alfatide PET/CT显示食管癌转移淋巴结的18F-Alfatide摄取值高于周围正常组织。食管癌淋巴结最大摄取值SU Vmax-LN、平均摄取值SUVavg-LN在性别分布上,差异未见统计学意义（P≥0.05）,淋巴结最大摄取值SUVmax-LN、平均摄取值SUVavg-LN在淋巴结转移组和非转移组差异具有统计学意义（P≤0.01）。4.30例食管鳞癌患者术后标本经免疫组织化学染色,αvβ3主要表达于细胞胞浆及胞膜,其中肿瘤组织阳性22例（73.3%）,阴性表达8例,正常食管组织阳性1例（10.0%）,阴性表达9例,差异具有统计学意义（P<0.01）,VEGF主要表达于细胞胞浆,其中肿瘤组织阳性26例（86.67%）,阴性表达4例,正常食管组织阳性2例（20.0%）,阴性表达8例,差异具有统计学意义（P<0.01）;MVD采用CD34计数,组织学见食管癌中MVD明显增多,阳性主要表达于小血管上皮细胞,且微血管管壁基底膜发生破坏,致使分布不均,以间质分布多,癌巢内分布少,平均值为21.07±6.432。5.分析食管癌组织中VEGF与αvβ3相关性,其结果显示,两者之间存在显着正相关性（r=0.681,P<0.01）;组间比较显示,VEGF 阳性组MVD的平均值为21.77±6.22,而在阴性组为16.50±6.76,MVD值差异无统计学意义（P>0.05）;αvβ3阳性组MVD（21.75±6.06）显着高于阴性组（11.5±3.54）,差异具有统计学意义（P<0.05）。6.αvβ3、VEGF表达在不同T分期、N分期间有明显差异（P<0.05）,随着T分期增高,αvβ3、VEGF表达水平升高,而淋巴结转移组的αvβ3、VEGF表达水平均明显高于无淋巴结转移组（P<0.05）。αvβ3表达水平与分化程度显着相关（P<0.05）,肿瘤组织分化程度越低αvβ3表达越高,反之分化程度越高αvβ3表达则越低。αvβ3随临床分期增加其表达水平显着升高（P<0.05）,MVD在不同N分期差异具有统计学意义（P<0.05）。比较其他临床资料间各指标的表达差异均无发现显着相关性（P>0.05）。7.αvβ3阳性患者组SUVmax显着高于阴性组（P=0.005）,两者呈显着正相关（r=0.545,P=0.002）;VEGF 阳性患者组 SUVmax 高于阴性组（P=0.033）,两者未见明显关联关系（r=0.128,P=0.499）,而MVD与SUVmax两者呈明显正相关（r=0.680,P=0.001）。结论18F-Alfatide PET/CT在食管癌能够清晰显像,对于食管癌诊断具有一定价值,可用于评价食管癌肿瘤血供、血管生成及其分布特征,在一定程度上反映食管癌的浸润情况,有助于判断食管癌生物学行为和预后。第二部分18F-Alfatide PET/CT与18F-FGD PET/CT在食管癌应用的对比研究目的研究18F-Alfatide PET/CT与18F-FGD PET/CT两种示踪剂在食管癌显像差异。方法61名胸段食管癌患者,术前1周内行18F-Alfatide PET/CT检查（n=29）和18F-FDG PET/CT检查（n=32）。检测肿瘤及淋巴结摄取值,根据术后病理分析确定TNM分期。记录清除淋巴结及阳性淋巴结数,并有病理验证,分别测量记录18F-Alfatide PET/CT and 18F-FDG PET/CT病变显影位置及相应摄取值。结果1.18F-FDG PET/CT或18F-Alfatide PET/CT检查在相同食管癌患者、同一病灶相同层面的影像征象,18F-FDG PET/CT摄取值高于18F-Alfatide PET/CT,但不同检测方法的差异无统计学意义。2.PET/CT摄取值（SUVs）的差异在18F-Alfatide PET/CT检查病例组,食管癌原发灶SUV值在性别（P=0.40）、病理分期（P=0.374）、T分期（P=0.205）、淋巴结状态（P=0.744）和分化程度（P=0.484）均无差异,而行18F-FDG PET/CT检查组也得出同样的结论,未见统计学差异（P值分别为0.575、0.81、0.134、0.511 和0.71）。18F-Alfatide PET/CT和 18F-FDG PET/CT两组患者淋巴结SUV值在病理分期、淋巴结状态均有统计学意义（P值分别为0.03和0.001;0.002和<0.001）,但是在性别（P=0.128,0.129）,T期（P=0.791,0.727）,肿瘤分化程度（P=0.049,0.053）无统计学差异。3.PET/CT摄取值与临床病理参数的相关性在18F-Alfatide PET/CT和18F-FDG PET/CT两组,食管癌原发灶摄取值与淋巴结摄取值、肿瘤长度、年龄、性别、病理分期、T分期、淋巴结状态、分化程度等无统计学差异,同样淋巴结摄取值与肿瘤长度、年龄、性别和T分期无统计学差异（P>0.05）。18F--Alfatide PET/CT检查组淋巴结摄取值和病理分期（r=0.52,P=0.016）、淋巴结是否转移（r=0.73,P<0.001）和分化程度（r=0.509,P<0.019）呈明显正相关,而18F-FDG PET/CT检查组也呈正相关,分别为r=0.503,P=0.01;r=0.649,P<0.001;r=0.459,P=0.021。4.PET/CT两种示踪剂对食管癌区域淋巴结诊断效能比较术前行18F-Alfatide PET/CT检查组食管癌患者术中共清扫419枚/95组淋巴结,其中49枚/28组经组织病理证实为转移淋巴结;术前行18F-FGD PET/CT检查组食管癌患者术中共清扫520枚/106组淋巴结,其中42枚/23组经组织病理证实为转移淋巴结。研究发现18F-Alfatide PET/CT、18F-FDG PET/CT食管癌区域淋巴结诊断的敏感性、特异性、准确度、阳性预测值和阴性预测值分别为67.9%VS 82.6%、95.5%VS 85.5%、87.4%VS 84.9%、86.4%VS 61.3%、87.7%VS 94.7%,P 值分别为:0.229、0.043、0.786、0.046、0.747,18F-Alfatide PET/CT 特异性、阳性预测值高于18F-FDG PET/CT,有统计学差异（P<0.05）,而二者的敏感性、准确度和阴性预测值差异无统计学意义（P>0.05）。结论转移淋巴结摄取值SUV-LN与病理分期、淋巴结状态及分化程度有关,也许可以成为食管癌患者预后风险分级的新参数。18F-Alfatide评估食管癌区域淋巴结较高的特异性及阳性预测值,具有积极诊断意义,为18F-Alfatide PET/CT替代18F-FDG PET/CT行食管癌检查提供参考。第三部分18F-Alfatide PET/CT纹理参数对食管癌分期及分化程度预测价值研究目的探讨18F-Alfatide PET/CT食管癌显像相关纹理参数与食管癌分期和分化程度的相关性及其预测价值。方法以食管癌患者的病理检查结果为金标准,对18F-Alfatide PET/CT显像获得的72个纹理参数进行ROC分析,筛选出曲线下面积（AUC）大于0.6的参数。分析剩余参数之间的相关性,筛选出与其他参数相关系数大于0.8的参数。分析残留参数与TNM分期的相关性。比较早期组（Ⅰ期-ⅡA期）与中晚期组（ⅡB期-Ⅳ期）各参数的差异,并进行Logistic回归分析,分析参数与分期的相关性。根据T分期、N分期和分化程度与帅选出参数进行ROC分析,选出AUC在0.6以上的参数,计算分类截止值。结果1.通过相关分析从纹理参数中经统计筛选出有预测价值的参数。研究发现纹理参数肿瘤体积（Tumor volume,TV）,最大标准化摄取值（Maximum SUV,SUVMa）和低强度区域调强（Low-intensity zone emphasis,LIZE）与 TNM 分期相关;最大标准化摄取值（Maximum SUV,SUVMa）、对比度（ConC）,低强度区域调强（Low-intensity zone emphasis,LIZE）和高强度大区域调强（High-intensity large-zone emphasis,HILZE）与早期或中晚期相关,其中SUVMa和ConC是独立的相关因子;2.肿瘤体积（Tumor volume,TV）、最大标准化摄取值（Maximum SUV,SUVMa）、平均 SUV（Mean SUV,SUVMe）、SUV 偏斜（SUV Skewness,SUVSk）、对比度（ConC）等与T分期相关,3.肿瘤体积（Tumor volume,TV）、最大标准化摄取值（Maximum SUV,SUVMa）、平均 SUV（Mean SUV,SUVMe）、SUV 偏斜（SUV Skewness,SUVSk）、对比度（ConC）和同质性（Homogeneity,HomC）与N分期相关。4.标准化摄取值峰度SUVKu、共生矩阵相关性CorC与分化程度相关。结论18F-Alfatide PET/CT食管癌显像所获得的部分纹理参数对食管癌的分期和分化程度有一定的预测价值。
廖小莉[10]（2019）在《THBS2在肝细胞癌表达的临床意义及其生物学功能的初探》文中研究指明原发性肝癌（Primary Liver Cancer,,PLC,简称肝癌）是全球最常见恶性肿瘤之一,发病率居第六位,死亡率居第四位,PLC中约90%是肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma,HCC）。全球一半肝癌的发病率和死亡率发生在中国。根治手术治疗是目前肝癌病人获得长期生存的最重要手段之一,但是术后的高复发率仍然是严重影响患者预后的重要因素。临床上观察到即使临床病理特征匹配的肝癌患者,术后无病生存期（disease free survival,DFS）却截然不同,这提示着人体内存在更精细的基因异常。蛋白质是基因功能的最终执行者,疾病发生、发展的根源与编码这些关键基因的蛋白质功能出现异常密切相关。因此本课题选择9对基线特征匹配的肝癌根治术后而术后DFS时间长短明显不同的患者标本,进行440个高通量蛋白质芯片筛选,找到相关的差异表达蛋白THBS2。并对THBS2在恶性肿瘤表达对患者预后的判断价值展开meta分析,在此基础上开展以下实验研究:（1）THBS2表达与肝细胞癌患者临床病理特征及预后的相关性;（2）在体外细胞水平上初步研究THBS2表达对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭生物学行为的影响。第一部分 高通量蛋白质芯片筛选肝癌根治术后复发转移的潜在标志物:THBS2目的:筛选肝癌患者根治术后影响复发转移的生物标志物。方法:将18例行肝癌根治术的肝细胞癌患者按照手术后不同的无病生存期分为两组:A组DFS>3年,B组DFS<1.5年,每组各9人。两组患者的临床病理基线特征匹配。将这18例患者的手术切除肿瘤组织样本抽提蛋白,用蛋白芯片（RayBiotech,GSH-CAA-440）检测与癌症发生相关的440个蛋白的含量。利用蛋白质组学的手段,对这18例患者中的蛋白表达特征进行了分析和探索。结果:A、B两组HCC患者中位DFS分别为58.0和15.5个月,P<0.001。我们根据火山图筛选出31个差异表达蛋白,其中25个蛋白在B组（易复发组）中高表达,而上调最显着的前五名依次是:MIP-1b、TIMP-2、MIP-1a、THBS2和AFP。热图分析显示THBS2的表达模式和AFP非常相似。GO功能及KEGG富集分析提示:肿瘤转移相关通路的主要调控蛋白有:MIP-1a、MIP-1b、THBS1、THBS2、VCAM-1、ICAM-2 等。蛋白互作分析结果提示:MIP-1a、MIP-1b、THBS1、THBS2均在蛋白互作网络的重要节点上。THBS2蛋白在B组的芯片扫描信号均值为:32969.11,A组为5875.96,B/A表达差异变化倍数为5.5（t=2.9,P=0.019）。THBS1蛋白B/A的表达差异变化倍数为 1.5（t=2.434,P=0.027）。结论:蛋白质组学技术筛选出与肝癌根治术后复发转移相关的潜在生物标志物:THBS2。第二部分 THBS2在恶性肿瘤的表达对患者预后判断价值的meta分析目的:依据单个研究的结果不足以评判THBS2是否可以作为一种有效的预后指标。因此,我们通过meta分析,以评估THBS2在恶性肿瘤的表达对患者预后判断的价值。方法:通过检索Pub-Med、Cochrane系统评论数据库、EM-BASE平台,用Stata15.0软件对文献中的诊断数据进行meta分析。采用危险比（HRs）和95%置信区间（CIs）作为评价标准,全面分析THBS2表达与肿瘤生存预后的相关性。采用Q检验和I2统计学双检验异质性。发表偏倚用漏斗图和Egger线性回归法进行评价。结果:13个研究2664名恶性肿瘤患者关于总生存（OS）的meta分析结果提示,THBS2高表达恶性肿瘤患者不良生存预后的风险是THBS2低表达患者的1.49倍（95%CI:1.34-1.66,P<0.001）。纳入的4篇文献中共含6组数据5000名恶性肿瘤患者关于无病生存（DFS）的meta分析结果提示,总的合并值为（HR=1.22,95%CI:1.11-1.35,P<0.001）,THBS2 表达量的升高与肿瘤患者不良生存预后的终点事件发生明显相关。结论:THBS2高表达与恶性肿瘤患者的不良生存预后明显相关,其可以考虑作为恶性肿瘤患者总生存和无病生存的一个预测指标。第三部分 THBS2表达与肝细胞癌患者临床病理特征及预后的相关性目的:本研究拟扩大样本量,分析THBS2表达与129例HCC患者临床病理特征及预后的相关性。方法:通过ELISA方法检测20例HCC患者癌及配对癌旁组织中THBS2表达,并应用相应的统计学方法分析THBS2的表达情况与129例HCC患者临床病理特征及预后的相关性。结果:THBS2蛋白在20例HCC癌组织中的表达水平显着高于配对癌旁组织（Z=-3.696,P<0.001）。THBS2在129例HCC癌组织中的表达与肿瘤数目（P=0.018）、BCLC分期（P=0.013）有关。THBS2在复发转移时间≤12m组、>12m且≤24m组、>24m组的总体表达差异具有统计学意义,THBS2表达水平越高,复发转移时间越早（χ2=11.758,P<0.05）。Kaplan-Meier生存分析结果提示,THBS2高表达的患者中位DFS、OS均短于THBS2低表达者（P=0.032,P=0.036）。肿瘤最大径>5cm,THBS2高表达患者根治术后出现复发转移时间更早,预后更差（P=0.002）。寿命表及Log-rank法分析结果显示:THBS2高表达组在3年、4年、5年的生存率均较THBS2低表达组差（P值均<0.05）。COX单因素分析提示:THBS2高表达、肿瘤数目>1个、有癌栓、病理恶性程度较高（低/中-低分化）、BCLC分期、TNM分期较晚均是HCC患者术后DFS和OS的不良预后因素（P值均<0.05）。肿瘤数目是影响HCC患者DFS、OS的独立危险因素（P<0.001）。结论:THBS2在HCC癌组织中高表达。THBS2高表达提示HCC患者复发转移风险更高,中位DFS及OS均更短,生存预后更差。第四部分 在体外细胞水平上研究THBS2过表达对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭生物学行为的影响。目的:探讨过表达THBS2对肝癌细胞HepG2、SMMC-7721生物学行为的影响。方法:通过qRT-PCCR和Western blot对正常人肝细胞LO2、四种人肝癌细胞 HepG2、SMMC-7721、MHCC-97H、Huh-7 中 THBS2 的表达情况进行检测。用构建的THBS2过表达重组慢病毒载体稳定转染肝癌细胞HepG2、SMMC-7721后,用CCK-8法、平板克隆形成实验、划痕实验和Transwell法测定转染目的基因后细胞的增殖、迁移及侵袭能力的变化。结果:qRT-PCR和Western blot结果显示,THBS2 mRNA和蛋白在肝癌细胞HepG2、SMMC-7721、MHCC-97H、Huh-7中的表达水平高于正常肝细胞LO2（P<0.05）。CCK-8法和平板克隆形成实验结果显示:过表达THBS2能够显着增强肝癌细胞的增殖能力（P<0.05）;划痕实验及Transwell迁移和侵袭实验结果显示:过表达THBS2后肝癌细胞的迁移、侵袭能力也明显增强（P<0.05）。结论:人肝癌细胞中THBS2呈高表达水平。过表达THBS2能明显增强肝癌细胞HepG2、SMMC-7721的增殖、迁移及侵袭能力,提示THBS2与肝癌细胞的恶性生物学行为有关。
二、结直肠癌微血管密度与生物学行为及预后相关性研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、结直肠癌微血管密度与生物学行为及预后相关性研究（论文提纲范文）
（1）ILT4调控非小细胞肺癌血管生成的作用和机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 ILT4对非小细胞肺癌血管生成的作用和预后分析 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 第二部分 ILT4调控非小细胞肺癌血管内皮细胞迁移和血管生成的机制研究 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 第三部分体内验证ILT4通过诱导血管生成促进肿瘤进展 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 综述:ILT4和VEGF-A的研究现状与进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文Ⅰ |
| 外文论文Ⅱ |
（2）华蟾素注射液治疗结肠癌腹水的优效人群分析及对VM的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 恶性腹水的中西医研究进展 |
| 1. 恶性腹水的西医研究进展 |
| 1.1 恶性腹水的形成机制 |
| 1.2 恶性腹水的西医诊断 |
| 1.3 恶性腹水的西医治疗 |
| 2. 恶性腹水的中医研究进展 |
| 2.1 恶性腹水的中医病因病机 |
| 2.2 恶性腹水的中医辨证 |
| 2.3 恶性腹水的中医治疗 |
| 3. 结语 |
| 参考文献 |
| 综述二 血管生成拟态(VM)在结肠癌中的研究进展 |
| 1. 结肠癌VM的发现及生物学特性 |
| 2. VM的形成机制 |
| 2.1 肿瘤缺氧微环境与VM |
| 2.2 肿瘤干细胞与VM |
| 2.3 上皮间质转化与VM |
| 2.4 促血管生成相关因子与VM |
| 2.5 VM形成相关信号通路 |
| 3. VM与结肠癌不良预后的相关性 |
| 4. VM与结肠癌的治疗 |
| 5. 结语 |
| 参考文献 |
| 综述三 华蟾素注射液干预肿瘤血管生成作用的研究进展 |
| 1. 肿瘤血管生成的病理机制 |
| 2. 华蟾素注射液的主要化学成分及其抗肿瘤作用 |
| 3. 华蟾素注射液干预肿瘤血管生成的机制 |
| 3.1 VEGF/VEGFR通路抑制作用 |
| 3.2 MMPs/TIMPs通路抑制作用 |
| 3.3 肿瘤血管内皮细胞诱导凋亡作用 |
| 3.4 其他潜在靶点 |
| 4. 结语 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第二部分 临床研究 华蟾素注射液腹腔灌注治疗结肠癌恶性腹水的疗效评价及优效人群分析 |
| 1. 资料与方法 |
| 1.1 研究方法 |
| 1.2 研究对象 |
| 1.3 病例筛选方法 |
| 1.4 治疗方法 |
| 1.5 提取指标 |
| 1.6 疗效评价 |
| 1.7 安全性评价 |
| 1.8 统计方法 |
| 1.9 技术路线图 |
| 2. 研究结果 |
| 2.1 总体资料分析 |
| 2.2 疗效评价 |
| 2.3 安全性评价 |
| 2.4 优效人群特征筛选 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 结肠癌恶性腹水的治疗现状 |
| 3.2 优效人群研究的必要性 |
| 3.3 华蟾素注射液治疗结肠癌恶性腹水的潜在机制 |
| 参考文献 |
| 第三部分 实验研究 基于血管生成拟态(VM)研究华蟾素注射液抑制结肠癌血性腹水的机制 |
| 实验一: 华蟾素注射液抑制裸鼠结肠癌血性腹水生成的研究 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 实验二: 华蟾素注射液体外抑制结肠癌细胞增殖、迁移、侵袭的研究 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 实验三: 华蟾素注射液体内、体外抑制结肠癌细胞VM形成的研究 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 实验四: 华蟾素注射液抑制结肠癌VM形成的机制研究 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 1. 研究结论 |
| 2. 研究创新性 |
| 3. 不足与展望 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）一、伴微血管侵犯肝细胞癌患者根治术后早期复发预测模型的建立、验证与评价 二、结直肠癌肝转移转录组特征及其免疫微环境与预后的相关性研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 第一部分 伴微血管侵犯肝细胞癌患者根治术后早期复发预测模型的建立、验证与评价 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 同时性结直肠癌肝转移转录组特征及其免疫微环境与预后的相关性研究 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 基金资助 |
| 已发表与学位论文相关的英文论文 |
| 文献综述 结直肠癌肝转移局部免疫微环境及机体整体免疫状态与预后的相关性研究 |
| 前言 |
| 一、结直肠癌肝转移原发灶及转移灶免疫微环境与预后的相关性 |
| 二、结直肠癌肝转移全身免疫状态与预后的相关性研究 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）LRG1在乳腺癌中表达的临床意义及其对乳腺癌细胞生物学行为的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 LRG1 在不同肿瘤中的表达及临床意义的生物信息学分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 乳腺癌组织中LRG1 蛋白表达与临床特征及生存预后的关系 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 LRG1 在乳腺癌细胞中的表达及其对乳腺癌细胞生物学行为的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 LRG1在恶性肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）非小细胞肺癌YAP1和SRPX2的表达与微血管密度及预后的相关性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 YES相关蛋白1在恶性肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
| 学位论文数据集 |
（6）胶质母细胞瘤临床和分子病理学特征及NTSR1促其增殖的分子机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 胶质母细胞瘤的临床和分子病理学研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 NTSR1-Wnt/β-Catenin正调控环路促胶质母细胞瘤生长的机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 胶质母细胞瘤上皮间叶转化机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 在读博士期间发表的论文 |
| 致谢 |
（7）CD34、D2-40和VEGF在结直肠癌中的表达及其与临床相关病理学特征的关系（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 资料与方法 |
| 结果 |
| 附图表 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 开题、中期及学位论文答辩委员组成 |
（8）GATA6/LOXL2复合体以及MACC1促进胆管癌血管生成的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| abstract |
| 中文摘要 |
| 第一部分 GATA6/LOXL2 复合体促进胆管癌血管生成的机制研究 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 数据库中分析GATA6和LOXL2 在胆管癌中的表达以及与VEGFA的相关性 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 GATA6/LOXL2 的表达与胆管癌患者临床病理特征的相关性 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 GATA6/LOXL2 复合体转录调控VEGFA的表达 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 GATA6/LOXL2 复合体上调VEGFA分泌促进胆管癌血管生成 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 本部分总结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 MACC1 促进胆管癌血管生成的机制研究 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 分析MACC1和VEGFA在胆管癌中表达 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 分析MACC1和VEGFA的表达与病人预后的关系 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 MACC1 上调VEGFA的表达并促进血管生成 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 本部分总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 赖氨酰氧化酶样蛋白2(LOXL2)与疾病的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（9）18F-Alfatide PET/CT食管癌整合素受体显像及图像纹理预测价值研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 ~(18)F-Alfatide PET/CT在食管癌显像及其与αvβ3、VEGF表达研究 |
| 1. 材料和方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.3 组织样本采集和免疫组化检测 |
| 1.4 数据处理与分析 |
| 2. 结果 |
| 2.1 入组患者信息 |
| 2.2 ~(18)F-Alfatide PET/CT影像分析 |
| 2.3 αvβ3、VEGF和MVD在食管癌中的表达及其与临床病理的关系 |
| 附图 |
| 附表 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 ~(18)F-Alfatide PET/CT在食管癌显像 |
| 3.2 αvβ3、VEGF和MVD在食管癌中的表达及~(18)F-Alfatide摄取 |
| 参考文献 |
| 第二部分 ~(18)F-Alfatide PET/CT与~(18)F-FGD PET/CT在食管癌应用的对比研究 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 实验步骤 |
| 1.3 图像处理 |
| 1.4 组织样本采集和病理分析 |
| 1.5 数据处理与分析 |
| 2. 结果 |
| 2.1 PET/CT两种示踪剂显像对比 |
| 2.2 PET/CT两种示踪剂在食管鳞状细胞癌显像对比 |
| 2.3 ~(18)F-Alfatide PET/CT对食管癌区域淋巴结诊断价值 |
| 附图 |
| 附表 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 FDG显像剂 |
| 3.2 摄取值与临床病理参数关系研究 |
| 3.3 PET/CT两种示踪剂对食管癌区域淋巴结诊断价值对比 |
| 参考文献 |
| 第三部分 ~(18)F-Alfatide PET/CT纹理参数对食管癌分期及分化程度预测价值研究 |
| 1. 资料与方法 |
| 1.1 病例 |
| 1.2 检查方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2. 结果 |
| 2.1 一般资料 |
| 2.2 PET/CT获取参数的初步筛选 |
| 2.3 PET/CT参数对食管癌早中晚期、TNM分期的提示意义 |
| 2.4 PET/CT参数对食管癌T分期的提示意义 |
| 2.5 PET/CT参数对食管癌N分期的提示意义 |
| 2.6 PET/CT参数对食管癌分化程度的提示意义 |
| 附图 |
| 附表 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 ~(18)F-Alfatide PET/CT在食管癌诊断的应用 |
| 3.2 纹理特征参数的应用价值 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 英文论文一 |
| 英文论文二 |
| 攻读博士学位期间相关研究成果 |
| 致谢 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（10）THBS2在肝细胞癌表达的临床意义及其生物学功能的初探（论文提纲范文）
| 个人简历 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 高通量蛋白质芯片筛选肝癌根治术后复发转移的潜在标志物:THBS2 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 THBS2在恶性肿瘤的表达对患者预后判断价值的meta分析 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 THBS2表达与肝细胞癌患者临床病理特征及预后的相关性 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 在体外细胞水平研究THBS2过表达对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭生物学行为的影响 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结与展望 |
| 附录 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士期间发表的学术论文 |
四、结直肠癌微血管密度与生物学行为及预后相关性研究（论文参考文献）
- [1]ILT4调控非小细胞肺癌血管生成的作用和机制研究[D]. 宫文静. 山东大学, 2021(11)
- [2]华蟾素注射液治疗结肠癌腹水的优效人群分析及对VM的作用机制研究[D]. 王一同. 北京中医药大学, 2021(01)
- [3]一、伴微血管侵犯肝细胞癌患者根治术后早期复发预测模型的建立、验证与评价 二、结直肠癌肝转移转录组特征及其免疫微环境与预后的相关性研究[D]. 张凯. 北京协和医学院, 2021(02)
- [4]LRG1在乳腺癌中表达的临床意义及其对乳腺癌细胞生物学行为的影响[D]. 张彦收. 河北医科大学, 2021(02)
- [5]非小细胞肺癌YAP1和SRPX2的表达与微血管密度及预后的相关性研究[D]. 王婷婷. 贵州医科大学, 2020(04)
- [6]胶质母细胞瘤临床和分子病理学特征及NTSR1促其增殖的分子机制研究[D]. 曾英. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020(01)
- [7]CD34、D2-40和VEGF在结直肠癌中的表达及其与临床相关病理学特征的关系[D]. 李鑫. 宁夏医科大学, 2020(08)
- [8]GATA6/LOXL2复合体以及MACC1促进胆管癌血管生成的机制研究[D]. 彭滔. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019(03)
- [9]18F-Alfatide PET/CT食管癌整合素受体显像及图像纹理预测价值研究[D]. 董印军. 山东大学, 2019(03)
- [10]THBS2在肝细胞癌表达的临床意义及其生物学功能的初探[D]. 廖小莉. 广西医科大学, 2019(08)