论文摘要
据报道,解脂耶氏酵母（Yarrawia lipolytica）中有8个脂肪酶基因,本实验克隆并表达了其中的脂肪酶基因7和8,不仅为解脂耶氏酵母脂肪酶基因家族的研究奠定了坚实基础,而且为开发与应用解脂耶氏酵母脂肪酶提供了基因资源。本研究借助生物信息学,利用AJ549519和AJ549520基因序列设计引物,克隆出解脂耶氏酵母脂肪酶基因7和8。测序结果显示:解脂耶氏酵母脂肪酶基因7和8的全长分别为1101bp和1116bp,基因中不含内含子,两个基因分别编码366个和371个氨基酸残基。在氨基酸水平上,其同源性和NCBI收录的解脂耶氏酵母脂肪酶7和8比对达到100%和99%。将该基因克隆到pPIC9K表达载体上,利用电转化首次实现了解脂耶氏酵母脂肪酶7和8在毕赤酵母GS115中的表达。发酵液上清经硫酸铵沉淀后透析,透析产物用SDS-PAGE法检测发现重组子在40KDa附近有特异性条带;摇瓶发酵96h后毕赤酵母分泌的重组脂肪酶7和8的水解酶活分别达到49.49U/L和35.98U/L。酶学性质的初步研究表明:解脂耶氏酵母脂肪酶7的最适温度为55℃,最适pH 8.0;在65℃中水浴2小时以后酶活力仅为处理前的29%;在pH 6.08.0范围内保持75%以上的酶活力;Mg2+对酶活力有显著促进作用;Cu2 +对酶活力有一定程度的抑制作用。解脂耶氏酵母脂肪酶8的最适温度为45℃,最适pH 8.0;50℃以下该脂肪酶较稳定,50℃以上酶活力开始明显降低;pH稳定性较好,在pH 6.08.0范围内保持90%以上的酶活力;Zn2+对酶活力有显著促进作用;Cu 2+、Mn2+对酶活力有一定程度的抑制作用。脂肪酶7和8均对中链酯（C4-C8）有较强的水解能力。首次尝试利用BioEdit软件、PSIPRED和SwissModel等服务器对解脂耶氏酵母脂肪酶7和8的一级结构、二级结构和三级结构进行分析,为解脂耶氏酵母脂肪酶7和8蛋白质结构的解析提供了支持。分析结果显示:预测的解脂耶氏酵母脂肪酶7和8在GHSLG区域具有高度的保守性;解脂耶氏酵母脂肪酶7的活性中心催化三联体为Ser192、Asp258、His271,其中α-螺旋占32.34%,β折叠占14.56%,其他结构占53.10%,Ala114、Asp115、Ala116、Ile117形成螺旋构成了脂肪酶的“盖子”结构覆盖在活性中心上方;解脂耶氏酵母脂肪酶8的活性中心催化三联体由Ser192、Asp258、His318构成,蛋白分子中α-螺旋占31.15%,β折叠占16.94%,其他结构占51.91%。