首页> 正文

IBV与IBDV二联核酸疫苗构建及与鸡IL-18共同免疫效力研究

2020-12-15阅读(548)

IBV与IBDV二联核酸疫苗构建及与鸡IL-18共同免疫效力研究

论文摘要

本研究首先对IBV S1、IBDV VP2基因进行亚克隆,并利用一段linker将IBV S1、IBDV VP2基因连接后,利用真核表达载体pVAX-1,通过基因重组分别构建真核重组表达质粒pVAX-IBV S1、pVAX-IBDV VP2和pVAX-IBV S1-linker-IBDV VP2。体外瞬时转染实验表明,外源基因能够在细胞内进行表达,并且表达后的蛋白可以被相应的IBV S1多克隆抗体和IBDV VP2多克隆抗体识别,说明了插入的外源基因具备各自的免疫反应性,为动物体内试验提供了基础。将试验鸡分为8组,即S1组（免疫pVAX-IBV S1真核重组质粒）、VP2组（免疫pVAX-IBDV VP2真核重组质粒）、SV组（免疫pVAX-IBV S1-linker-IBDV VP2真核重组质粒）、SV18组（免疫pVAX-IBV S1真核重组质粒和pVAX-ChIL-18真核重组质粒）、18组（免疫pVAX-ChIL-18真核重组质粒）、YM组（免疫IBVH120疫苗和IBDV疫苗）、PBS组（免疫PBS）、pVAX组（免疫pVAX空载体质粒）。免疫过程中利用淋巴细胞增殖试验、酶联免疫吸附试验、中和抗体试验以及利用流式细胞术检测CD4+、CD8+T淋巴细胞动态变化,对不同日龄的试验动物进行检测,最后用病毒攻击试验比较免疫不同质粒组别之间保护率。实验结果表明,二联核酸疫苗对两种病毒的攻击有一定的保护作用,添加了ChIL-18作为免疫佐剂增强了二联核酸疫苗的免疫效果,同时增加了核酸疫苗对病毒攻击的保护力。

论文目录

  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 1 前言
  • 1.1 鸡传染性支气管炎研究进展
  • 1.1.1 IBV 的生物学分类地位
  • 1.1.2 IBV 粒子结构
  • 1.1.3 IBV 结构蛋白及其生物学功能
  • 1.1.4 IBV 理化特性
  • 1.1.5 IBV 疫苗研究进展
  • 1.2 鸡传染性法氏囊研究进展
  • 1.2.1 IBDV 生物学分类
  • 1.2.2 IBDV 粒子结构
  • 1.2.3 IBDV 的结构蛋白及生物学功能
  • 1.2.4 IBDV 理化特性
  • 1.2.5 IBDV 疫苗研究进展
  • 1.3 鸡白细胞介素（INTERLEUKIN）研究进展
  • 1.3.1 鸡白介素1（ChIL-1）
  • 1.3.2 鸡白介素2（ChIL-2）
  • 1.3.3 鸡白介素6（ChIL-6）
  • 1.3.4 鸡白介素15（ChIL-15）
  • 1.3.5 鸡白介素18（ChIL-18）
  • 1.4 研究的目的与意义
  • 2 材料与方法
  • 2.1 试验材料
  • 2.1.1 病毒株
  • 2.1.2 试验动物
  • 2.1.3 细胞株、菌株、载体及质粒
  • 2.1.4 主要工具酶、抗体及分子生物学试剂盒
  • 2.1.5 主要生化试剂
  • 2.1.6 主要实验仪器设备
  • 2.2 试验方法
  • 2.2.1 IBV S1 基因、IBDV VP2 基因的亚克隆及其真核表达质粒的构建
  • 2.2.2 IBV S1、IBDV VP2 融合基因真核表达质粒的构建
  • 2.2.3 抗IBDV VP2 蛋白多克隆抗体的制备和鉴定
  • 2.2.4 pVAX-IBV S1、pVAX-IBDV VP2、pVAX-IBV S1-linker-IBDV VP2 重组质粒体外瞬时表达及其表达产物的检测
  • 2.2.5 pVAX-IBV S1、pVAX-IBDV VP2 重组质粒稳定表达细胞系的建立和鉴定
  • 2.2.6 实验动物分组、免疫及各组免疫效果的检测
  • 2.3 数据处理
  • 3 试验结果
  • 3.1 IBV S1 基因、IBDV VP2 基因的亚克隆及其真核表达质粒的构建及鉴定
  • 3.1.1 pVAX-IBV S1 重组质粒的构建及鉴定
  • 3.1.2 pVAX-IBDV VP2 重组质粒的构建与鉴定
  • 3.2 PVAX-IBV S1-IBDV VP2 重组质粒的构建与鉴定
  • 3.2.1 IBV S1、IBDV VP2 片断的亚克隆
  • 3.2.2 pVAX-IBV S1-IBDV VP2 重组质粒的PCR 及双酶切鉴定
  • 3.2.3 pVAX-IBV S1-IBDV VP2 重组质粒的测序鉴定
  • 3.3 抗IBDV VP2 蛋白多克隆抗体的制备及鉴定
  • 3.3.1 pGEX-IBDV VP2 原核表达质粒的单双酶切鉴定
  • 3.3.2 间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测多抗效价
  • 3.3.3 western blot 检测多抗特异性
  • 3.4 PVAX-IBV S1、PVAX-IBDV VP2、PVAX-IBV S1-LINKER-IBDV VP2 重组质粒体外瞬时表达及其表达产物的检测
  • 3.4.1 pVAX-IBV S1 真核表达质粒体外转染及其检测
  • 3.4.2 pVAX-IBDV VP2 真核表达质粒体外转染及其检测
  • 3.4.3 pVAX-IBV S1-linker-IBDV VP2 真核表达质粒体外转染及其检测
  • 3.5 PVAX-IBV S1、PVAX-IBDV VP2 重组质粒稳定表达细胞系的建立
  • 3.5.1 RT-PCR 方法检测pVAX-IBV S1、pVAX-IBDV VP2 基因的表达
  • 3.5.2 间接免疫荧光检测pVAX-IBV S1、pVAX-IBDV VP2 重组质粒在两种稳定表达细胞系中的表达
  • 3.6 雏鸡外周血及免疫器官T、B 淋巴细胞增殖的动态变化
  • 3.6.1 雏鸡血液T 淋巴细胞增殖的动态变化
  • 3.6.2 雏鸡血液B 淋巴细胞增殖的动态变化
  • 3.6.3 雏鸡胸腺T 淋巴细胞增殖的动态变化
  • 3.6.4 雏鸡脾脏T 淋巴细胞增殖的动态变化
  • 3.6.5 雏鸡脾脏B 淋巴细胞增殖的动态变化
  • 3.7 雏鸡外周血及免疫器官CD4+、CD8+T 淋巴细胞动态变化
  • 3.7.1 雏鸡外周血及免疫器官CD4+T 淋巴细胞动态变化
  • 3.7.2 雏鸡外周血及免疫器官CD8+T 淋巴细胞动态变化
  • 3.8 雏鸡外周血抗IBV、IBDV 抗体含量动态变化
  • 3.8.1 雏鸡外周血抗IBV 抗体含量动态变化
  • 3.8.2 雏鸡外周血抗IBDV 抗体含量动态变化
  • 3.9 各组雏鸡细胞毒性T 淋巴细胞的检测
  • 3.9.1 各组雏鸡细胞毒性T 淋巴细胞（CTL）杀伤分泌IBVS1 靶细胞的检测
  • 3.9.2 各组雏鸡细胞毒性T 淋巴细胞杀伤分泌IBDV VP2 靶细胞的检测
  • 3.10 中和抗体
  • 3.11 攻毒后雏鸡病变的观察结果
  • 3.12 保护率计算结果
  • 4 讨论
  • 4.1 融合基因真核载体表达质粒的设计与构建
  • 4.2 多克隆抗体的制备及其效价鉴定结果分析
  • 4.3 融合基因真核载体表达质粒体外瞬时转染鉴定结果及分析
  • 4.4 融合基因真核载体表达质粒体外稳定转染及CTL 活性测定
  • 4.5 雏鸡进行核酸免疫的讨论与分析
  • 4.6 雏鸡免疫后淋巴细胞增殖功能变化结果分析
  • 4.6.1 雏鸡免疫后血液及免疫器官T 淋巴细胞增殖活性分析
  • 4.6.2 雏鸡免疫后血液及免疫器官B 淋巴细胞增殖活性分析
  • 4.7 雏鸡免疫后不同亚型T 细胞动态变化结果分析
  • +T 细胞动态变化结果分析'>4.7.1 雏鸡免疫后免疫器官及血液CD4+T 细胞动态变化结果分析
  • +T 细胞动态变化结果分析'>4.7.2 雏鸡免疫后免疫器官及血液CD8+T 细胞动态变化结果分析
  • 4.8 外周血液抗IBV 和IBDV IGG 抗体含量动态变化结果分析
  • 4.9 病毒攻击试验雏鸡后病理学观察结果、感染率及保护率计算结果的讨论与分析
  • 4.10 免疫效果比较分析
  • 5 结论
  • 致谢
  • 参考文献
  • 攻读硕士学位期间发表的学术论文

    • 相关论文文献

    • [1].IBDV感染雏鸡盲肠扁桃体的病理组织学变化[J]. 河南科技学院学报(自然科学版) 2016(03)
    • [2].鸡传染性腔上囊病病毒(IBDV)感染雏鸡免疫器官巨噬细胞的数量变化[J]. 中国兽医杂志 2017(01)
    • [3].IBDV致雏鸡非免疫器官损伤的动态变化[J]. 河南科技学院学报(自然科学版) 2017(04)
    • [4].盐酸川芎嗪体外抗IBDV活性及其作用机制[J]. 中国兽医学报 2014(01)
    • [5].珍珠鸡源IBDV的分离鉴定及其卵黄抗体的制备[J]. 经济动物学报 2012(02)
    • [6].试纸条法与琼脂扩散法检测IBDV抗体的比较(英文)[J]. Agricultural Science & Technology 2012(09)
    • [7].黄连解毒汤对IBDV感染鸡胚及雏鸡免疫功能的影响[J]. 畜牧与兽医 2009(11)
    • [8].基因重组乳酸菌r-L.Lactis-VP_2-RCK对IBDV母源抗体不同水平雏鸡的免疫效果[J]. 动物医学进展 2020(05)
    • [9].灵芝多糖对人工感染IBDV雏鸡免疫抑制的调节作用[J]. 黑龙江畜牧兽医 2020(08)
    • [10].基于不同引物的RT-PCR检测IBDV敏感性的比较[J]. 中国动物检疫 2010(03)
    • [11].两种来源的IBDV抗原制备单克隆抗体的比较[J]. 安徽农业科学 2010(28)
    • [12].正交实验优选黄芪多糖硫酸化修饰条件及修饰产物抗IBDV活性测定[J]. 中药材 2008(04)
    • [13].IBDV引起肉鸡法氏囊凋亡相关基因表达变化的机制研究[J]. 西北农林科技大学学报(自然科学版) 2020(08)
    • [14].用噬菌体肽库筛选IBDV单克隆抗体的模拟表位[J]. 中国免疫学杂志 2012(03)
    • [15].卡介菌多糖核酸对IBDV感染鸡的免疫活性研究[J]. 南京农业大学学报 2010(06)
    • [16].红景天多糖体外抑制IBDV感染CEF活性试验[J]. 安徽农业科学 2011(34)
    • [17].外源性核酸对感染IBDV雏鸡免疫功能和抗氧化能力的影响[J]. 中国兽医学报 2009(05)
    • [18].传染性法氏囊病毒HN株的分离鉴定及应用免疫荧光检测IBDV[J]. 河南农业科学 2008(01)
    • [19].抗菌肽Gal-13在感染IBDV雏鸡体液表达和肠道中的分布变化[J]. 中国兽医学报 2009(01)
    • [20].IBDV感染不同阶段雏鸡睾丸NGF表达[J]. 西北农业学报 2015(03)
    • [21].淫羊藿多糖的硫酸化修饰及其对IBDV感染细胞的影响[J]. 畜牧兽医学报 2008(02)
    • [22].泰山松花粉多糖对超强毒IBDV克隆化毒株的免疫增强效果[J]. 中国兽医学报 2015(01)
    • [23].传染性法氏囊病毒的生物学特性研究进展[J]. 青海畜牧兽医杂志 2008(01)
    • [24].硫酸化黄芪多糖对CEF生长及抵抗IBDV感染的影响[J]. 南京农业大学学报 2009(01)
    • [25].IBDV感染雏鸡法氏囊和脾脏中抗病毒基因Mx的表达变化[J]. 中国家禽 2016(18)
    • [26].IBDV感染雏鸡外周血液淋巴细胞chMDA5信号通路因子表达的动态变化[J]. 畜牧兽医学报 2015(05)
    • [27].荧光定量RT-PCR鉴别IBDV超强毒株与经典疫苗毒株[J]. 上海交通大学学报(农业科学版) 2009(02)
    • [28].IBDV血清Ⅱ型VP5蛋白原核表达及型特异性单克隆抗体的制备[J]. 中国预防兽医学报 2009(04)
    • [29].IBDV抗原表位与VP2组合基因的分子构建及其在昆虫细胞中的表达[J]. 中国兽医学报 2010(10)
    • [30].IBDV超强毒GX8/99株细胞适应毒及其鸡体回传毒的致病性、免疫原性比较[J]. 中国兽药杂志 2008(10)

    标签：;  ;  ;  ;  

    IBV与IBDV二联核酸疫苗构建及与鸡IL-18共同免疫效力研究
    下载Doc文档

    猜你喜欢

    © 2024 毕速过 版权所有 鄂ICP备12018319号-5