逆转录病毒载体介导的丙型肝炎病毒（HCV）囊膜蛋白基因的表达及抗HCV中和抗体的研究

论文题目: 逆转录病毒载体介导的丙型肝炎病毒（HCV）囊膜蛋白基因的表达及抗HCV中和抗体的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 临床兽医学

作者: 许信刚

导师: 张彦明

关键词: 丙型肝炎病毒,囊膜蛋白,逆转录病毒载体,中和抗体,假病毒

文献来源: 西北农林科技大学

发表年度: 2005

论文摘要: 丙型肝炎病毒(HCV)是输血后非甲非乙型肝炎以及社区获得性肝炎的主要病原因子,目前全世界约有2 亿HCV感染者。HCV感染后缺乏有效的保护性免疫。目前对HCV感染尚未找到有效的治疗手段,因此需要提高治疗手段和发展有效的疫苗以控制HCV感染。HCV 为单股正链RNA 病毒,属于黄病毒科的成员。其基因组全长9.4kb,编码约3 000 氨基酸的多聚蛋白前体,在宿主及病毒蛋白酶的作用下,将其切割成3 个结构蛋白和7 个非结构蛋白,其中有2 个糖蛋白E1 和E2 为HCV的包膜蛋白。由于其位于病毒颗粒的最外侧,是宿主免疫系统攻击的主要目标,也是HCV 疫苗研究的首选抗原。近年来各国学者运用基因重组技术对HCV包膜糖蛋白的结构和功能进行了深入研究,以期进一步理解HCV感染后慢性化机制及病毒与宿主相互作用的关系,并寻找有效的保护性疫苗及治疗药物。Chiron公司的研究人员在1994 年首先报道了用哺乳动物细胞表达的E1 和E2 蛋白共免疫大猩猩,可诱生出中和抗体能抵抗同源病毒攻击的。他们认为在大猩猩免疫试验中,E2 区尤其是E2 的高变区之一HVR1(386～411 位氨基酸)对于诱导中和抗体的保护性免疫具有更为重要的作用。但是由于E2 区的高度变异性,针对某种型或株的抗体往往对其他型或株的HCV 无中和作用。而且有的学者认为抗E2 抗体对病毒感染的预防作用仍难以肯定。由于尚未建立HCV 体外复制系统,病人血清中的HCV 病毒粒子又极难纯化,迄今为止的HCV被膜蛋白研究几乎完全以各种系统中表达的重组蛋白为对象。有证据表明,只有哺乳动物细胞中表达的E1、E2 糖蛋白才能较好地反映天然HCV病毒粒子上被膜蛋白的构象和性质。但就目前而言,E1 及E2 糖蛋白在哺乳动物细胞中的高效表达,以及表达蛋白的纯化,仍然是世界范围内都未攻克的难题,严重影响了被膜蛋白相关研究及其临床应用的进展,说明HCV 中和抗体的研究还面临许多困难。本研究由三部分构成,第一部分是用逆转录病毒载体将HCV囊膜蛋白基因整合到SP2/0 细胞基因组中,在SP2/0 细胞的细胞膜上成功表达了HCV 囊膜蛋

论文目录:

中文摘要

英文摘要

文献综述

第一章丙型肝炎病毒的分子生物学研究进展

1.1 引言

1.2 丙型肝炎的流行现状、致病性与危害

1.3 病毒的颗粒特征

1.4 丙型肝炎病毒各区段基因组的结构和功能

1.4.1 5’非编码区(5’UTR)

1.4.2 核心蛋白区

1.4.3 包膜蛋白区

1.4.4 p7 蛋白

1.4.5 非结构蛋白

1.4.6 3'非编码区(3'UTR)

1.5 丙型肝炎病毒囊膜蛋白的研究进展

1.5.1 包膜蛋白的结构

1.5.2 E2 蛋白在HCV入胞过程中的作用

1.5.3 E2 与机体免疫反应

1.6 丙型肝炎病毒基因的变异及分型

1.6.1 HCV 的变异机制

1.6.2 HCV 各基因的变异情况

1.6.3 HCV 基因分型研究

1.6.4 HCV 基因型的地理分布特点

1.6.5 HCV 基因分型的方法

1.7 HCV 的体外复制模型及感染动物模型研究

1.7.1 HCV 体外复制模型

1.7.2 黑猩猩

1.7.3 猴

1.7.4 树鼩

1.7.5 转基因和免疫耐受人鼠嵌合肝模型

1.8 丙型肝炎病毒感染的免疫反应

1.8.1 体液免疫应答

1.8.2 细胞免疫应答

1.9 丙型肝炎预防和治疗

1.9.1 干扰素(IFN)

1.9.2 病毒唑

1.9.3 LAK 细胞治疗

1.9.4 熊去氧胆酸治疗

1.9.5 免疫调节剂

1.9.6 联合用药

1.9.7 中医中药

1.9.8 丙型肝炎预防

1.10 丙型肝炎疫苗研究

1.10.1 重组HCV 蛋白质疫苗

1.10.2 HCV 基因疫苗

1.10.3 HCV 融合基因疫苗

1.10.4 丙肝肝炎口服活菌苗

1.10.5 丙肝疫苗研制面临的问题

1.11 丙型肝炎病毒单克隆抗体(HCV-McAb)的研究

1.11.1 鼠源HCV 单克隆抗体

1.11.2 人源HCV 单克隆抗体

1.11.3 HCV单克隆抗体的意义及其发展前景

1.12 丙型肝炎病毒的实验室诊断研究进展

1.12.1 血清抗-HCV 抗体检测

1.12.2 HCV RNA检测用于HCV 感染的诊断

1.12.3 HCV 抗原的检测

1.13 丙型肝炎的研究展望

1.13.1 规范分型

1.13.2 细胞与动物模型

1.13.3 大容量噬菌体抗体库与肽库的构建

1.13.4 基因的表达调控

1.13.5 发病机制

1.13.6 HCV 受体

1.13.7 治疗

1.13.8 疫苗

试验研究

第二章 HCV 囊膜蛋白基因E1E2 的亚克隆及序列分析

2.1 材料

2.1.1 含有HCV 囊膜蛋白基因组的质粒

2.1.2 主要试剂

2.1.3 载体和菌种

2.1.4 PCR 引物

2.1.5 培养基

2.1.6 主要仪器

2.2 方法

2.2.1 引物的设计与合成

2.2.2 目的基因的扩增、纯化和回收

2.2.3 纯化产物与PGEM-T easy Vector 连接

2.2.4 新鲜感受态细胞的制备(CaCl_2 法)

2.2.5 连接产物的转化

2.2.6 重组质粒的提取

2.2.7 重组质粒的鉴定

2.2.8 序列的计算机分析

2.3 结果

2.3.1 PCR 产物的电泳结果

2.3.2 重组质粒的PCR 鉴定结果

2.3.3 组质粒的酶切鉴定结果

2.3.4 测序结果

2.3.5 氨基酸序列分析结果

2.3.6 HCV E1E2 基因编码蛋白质的理化性质分析

2.4 讨论

2.5 小结

第三章逆转录病毒载体介导的HCV囊膜蛋白基因E1E2在真核细胞中的表达及动物免疫试验

3.1 材料

3.1.1 主要试剂

3.1.2 细胞系

3.1.3 试验动物

3.1.4 质粒

3.1.5 载体核菌株

3.1.6 培养基

3.1.7 主要仪器

3.2 方法

3.2.1 逆转录病毒表达质粒的构建

3.2.2 逆转录病毒假病毒制备

3.2.3 逆转录病毒假病毒侵染SP 2/0 细胞及抗性筛选表达细胞

3.2.4 FACS 分析筛选膜表面表达E1E2 蛋白的SP 2/0 细胞

3.2.5 表达E1E2 囊膜蛋白的 SP2/0 细胞免疫Balb/c 小鼠

3.2.6 小鼠采血及血清分离

3.2.7 血清抗体的检测

3.2.8 血清中和抗体检测

3.3 结果

3.3.1 重组质粒的PCR 鉴定结果

3.3.2 组质粒的酶切鉴定结果

3.3.3 HCV E1E2 基因的核苷酸和相应的氨基酸序列

3.3.4 FACS 分析检测表达E1E2 囊膜蛋白的 SP2/0 细胞

3.3.5 免疫小鼠血清抗体的FACS 检测

3.3.6 中和抗体检测结果

3.4 讨论

3.5 小结

第四章 HCV 囊膜蛋白单克隆抗体的制备

4.1 材料

4.1.1 主要试剂

4.1.2 细胞系

4.1.3 试验动物

4.1.4 主要仪器

4.2 方法

4.2.1 免疫原的制备

4.2.2 动物免疫

4.2.3 骨髓瘤细胞的准备

4.2.4 脾淋巴细胞的准备

4.2.5 细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养

4.2.6 阳性杂交瘤细胞的筛选

4.2.7 阳性杂交瘤细胞的克隆

4.2.8 杂交瘤细胞的冻存与复苏

4.2.9 小鼠腹水的制备

4.2.10 单抗中和活性的检测

4.3 结果

4.3.1 分泌特异单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立

4.3.2 中和抗体检测结果

4.4 讨论

4.5 小节

第五章丙型肝炎病毒核酸疫苗的构建及动物免疫试验

5.1 材料

5.1.1 主要试剂

5.1.2 细胞系

5.1.3 试验动物

5.1.4 基因组质粒

5.1.5 载体和菌株

5.1.6 培养基

5.1.7 主要仪器

5.2 方法

5.2.1 引物的设计

5.2.2 目的基因的扩增、纯化和回收、纯化产物与PGEM-T easy Vector 连接、新鲜感受态细胞的制备(CaCl_2 法)、连接产物的转化、重组质粒的提取

5.2.3 重组质粒的鉴定

5.2.4 真核表达质粒的构建

5.2.5 重组真核表达质粒转染293T 细胞

5.2.6 FACS 分析表达E1E2 蛋白的293T 细胞

5.2.7 重组真核表达质粒的大量提

5.2.8 重组真核表达质粒免疫Balb/c 小鼠取

5.2.9 免疫小鼠采血及血清分离

5.2.10 免疫小鼠血清抗体的检测

5.2.11 小鼠血清中和抗体的检测

5.3 结果

5.3.1 PCR 产物的电泳结果

5.3.2 重组pGEM-T Easy载体质粒的酶切鉴定结果

5.3.3 重组质粒的酶切鉴定结果

5.3.4 重组质粒的测序结果

5.3.5 FACS 分析重组真核表达质粒转染293T 细胞瞬时表达

5.3.6 免疫小鼠血清抗体的FACS 检测

5.3.7 中和抗体检测结果

5.4 讨论

5.5 小节

第六章 HCV 囊膜蛋白基因E1 和E2 原核表达载体的构建及表达

6.1 材料

6.1.1 菌株和质粒

6.1.2 酶和试剂

6.1.3 阳性血清及酶标抗体

6.1.4 主要仪器设备

6.2 方法

6.2.1 引物的设计与合成

6.2.2 目的基因的扩增、纯化和回收、纯化产物与PGEM-T easy Vector 连接、新鲜感受态细胞的制备(CaCl_2 法)、连接产物的转化、重组质粒的提取、重组质粒的鉴定

6.2.3 原核重组表达载体的构建与鉴定

6.2.4 E2 基因在大肠杆菌中的表达

6.2.5 表达蛋白的鉴定

6.3 结果

6.3.1 重组原核表达载体E1-pET32a 和E2-pET32a 的PCR鉴定

6.3.2 重组原核表达载体E1-pET32a 和E2-pET32a 的酶切鉴定

6.3.3 重组原核表达载体序列测定

6.3.4 表达蛋白的SDS-PAGE 检测

6.3.5 表达蛋白的Western blot 检测

6.4 讨论

6.5 小结

结论

参考文献

缩略词英汉对照表

致谢

作者简介

发布时间: 2005-12-22

参考文献

[1].HIV-1 Thai-B亚型感染性克隆的构建及其在中和抗体检测和疫苗研究中的初步应用[D]. 王铮.中国人民解放军军事医学科学院2008
[2].宿主抗肠病毒非中和抗体反应特点的研究[D]. 丁莹莹.第二军医大学2016
[3].活化广谱抗流感病毒中和抗体的组合疫苗研究[D]. 周慧.苏州大学2016
[4].高变区1抑制丙型肝炎病毒包膜蛋白E2诱生交叉中和抗体[D]. 刘媛.第二军医大学2011
[5].中和抗体结合MCP-1对狂犬病暴露后预防研究及嵌合糖蛋白重组狂犬病病毒的构建[D]. 李真光.中国农业科学院2014
[6].无感染增强的广谱抗登革病毒中和抗体的构建及机制研究[D]. 姬广辉.第二军医大学2011
[7].高通量人乳头瘤病毒及人类免疫缺陷病毒假病毒检测体系的建立及应用[D]. 聂建辉.吉林大学2015
[8].冻干人用狂犬病脂质体疫苗的研究[D]. 郭秀侠.吉林大学2009
[9].普通人群血清中的腺病毒中和抗体调查及3型腺病毒中和表位的鉴定和分析[D]. 盛慧英.南方医科大学2013
[10].诱导HIV-1膜蛋白保护性抗体免疫策略的研究[D]. 刘建东.中国疾病预防控制中心2016

逆转录病毒载体介导的丙型肝炎病毒（HCV）囊膜蛋白基因的表达及抗HCV中和抗体的研究

猜你喜欢