细胞内钙在内皮素-1促肺腺癌细胞SPC-A1生长中的作用及机制

论文摘要

非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）是目前死亡原因居首位的恶性肿瘤之一,起病隐匿,发现时40%为晚期患者,预后差。晚期NSCLC的一线标准治疗是以铂类为基础的联合化疗。Meta分析显示与最佳支持治疗相比,以铂类为基础的联合化疗中位生存期延长2个月,1年生存率提高10%。尽管铂类为基础的联合化疗在晚期NSCLC治疗中取得一些进展,但其疗效似已达平台,一线治疗的有效率很少超过40%,1年生存率多在30%～40%,且以铂类为基础的联合化疗毒副作用大。因此,寻找一种高效低毒的治疗方法势在必行。随着对肿瘤生物学认识的加深,针对细胞受体、基因、调控分子等信号转导为靶点的分子靶向治疗（Molecular Targeted threapy）是近年肿瘤学研究的热点。NSCLC目前主要的分子靶点药物主要针对表皮生长因子受体（EGFR）及血管内皮生长因子（VEGF）,上述靶向药物单药治疗晚期NSCLC取得一定的疗效,但有效率低。不同靶向药物的联合使用及寻找新的靶向药物是目前肿瘤治疗的新趋势。内皮素-1（Endothelin-1,ET-1）是强大的血管收缩剂,ET-1通过内皮素受体（Endothelin receptors,ETRs）起作用,内皮素受体有A（ETAR）和B（ETBR）两种亚型,它们都属于G蛋白偶联受体,ET-1通过ETRs产生生物学效应。既往的研究表明,内皮素系统与肿瘤关系密切。内皮素系统通过促进肿瘤细胞生长、诱导肿瘤血管形成、抑制肿瘤细胞凋亡及促肿瘤骨转移等方面在肿瘤发生发展过程中起重要作用。有研究证实,肺癌组织及细胞存在ET-1及ETRs,肺癌细胞株可自行合成、释放ET-1及表达ETRs,肺癌患者血浆及支气管灌洗液中ET-1水平高于正常人,说明内皮素系统与肺癌也关系密切。因此,内皮素系统有望成为肺癌靶向治疗的新靶点,研究内皮素系统与肺癌细胞生长及其信号转导机制具有重要意义。ET-1是强大的细胞促有丝分裂素,既往研究显示,ET-1在体外能够促进血管内皮素细胞、成纤维细胞等正常细胞增殖,同时ET-1也能够促进卵巢癌、胶质瘤等肿瘤细胞生长,且其促细胞生长作用与细胞内游离钙离子(Intracellar freeCa2+,[Ca2+]i)有关。ET-1激活ETRs后使电压依赖性和受体操纵性钙通道开放,促使细胞外Ca2+内流,Ca2+内流触发细胞内Ca2+释放;激活的ETRs还可通过磷脂酶活化三磷酸肌醇（IP3）促使Ca2+从贮存库释放至肌浆,使[Ca2+]i增多。Ca2+是细胞内重要的第二信使,也作为细胞核内的信号参与DNA复制、修复、基因转录、核蛋白磷酸化等过程,参与许多重要生命活动的调节。[Ca2+]i在ETRs促血管平滑肌细胞增值及部分肿瘤细胞如头颈癌和卵巢癌细胞生长中起重要作用。而在肺癌细胞上ET-1与肺癌细胞生长关系及其机制目前尚未阐明,本实验拟通过体外培养肺腺癌SPC-A1细胞株,探讨:1、ET-1在SPC-A1细胞生长中的作用;2、钙信号在ET-1促SPC-A1细胞增殖过程中的作用及其机制。第一部分内皮素-1及其受体在肺腺癌细胞SPC-Al生长中的作用采用MTT（四甲基偶氮唑盐）比色法检测肿瘤细胞生长,探讨ET-1在肺腺癌细胞生长中的作用。实验结果以均数±标准差（（?）±s）表示,相关数据采用SPSS11.5软件进行分析,两组之间比较采用t检验;多组之间比较采用one-way ANOVA方差分析,而后不同组间比较采用LSD检验,实验组与对照组比较用Dunnett’s检验。P＜0.05判定为差异有统计学意义。结果显示:1.ET-1(10-15mol/L～10-8mol/L)具促进SPC-A1细胞增殖作用,在10-15mol/L～10-10mol/L浓度范围,作用呈浓度依赖性,差异有显著性（F=502.493,P=0.000＜0.05）。在10-10mol/L～10-8mol/L时作用呈饱和状态。2.ET-1(10-10mol/L)促SPC-A1细胞增殖作用可被ETAR拮抗剂BQ123(10-7mol/L)阻断（P=0.001＜0.05）,不受ETBR拮抗剂BQ788(10-7mol/L)影响（P=0.872＞0.05）。说明ET-1促SPC-A1细胞生长作用是通过作用于细胞膜ETAR。第二部分内皮素-1对人肺腺癌SPC-A1细胞内游离钙离子的影响及机制采用Fura-2/AM荧光技术测细胞内游离钙离子浓度([Ca2+]i),检测ET-1促肺腺癌SPC-A1细胞[Ca2+]i浓度升高的作用及其信号转导机制。实验结果以均数±标准差（（?）±s）表示,相关数据采用SPSS11.5软件进行分析,两组之间比较采用t检验;多组之间比较采用one-way ANOVA方差分析,而后不同组间比较采用LSD检验,实验组与对照组比较用Dunnett’s检验。P＜0.05判定为差异有统计学意义。结果显示:1.ET-1在体外能够促进肺腺癌细胞SPC-A1细胞[Ca2+]i浓度升高,ET-1(10-15mol/L～10-8mol/L)呈浓度依赖性,差异有显著性（F=7284.365,P=0.000＜0.05）。其作用能够被ETAR特异性拮抗剂BQ123完全阻滞（P=0.001＜0.05）,ET-1通过ETAR促SPC-A1细胞[Ca2+]i升高。ET-1促SPC-A1细胞[Ca2+]i浓度升高由起始的快速上升期和接下来的平台期两个时相组成,由基础值的57.5±11.9nmol/L,上升到最高89.5±19.5nmol/L。2.细胞外无Ca2+溶液,[Ca2+]i基础值显著降低,同时ET-1促[Ca2+]i的升高的作用可显著减弱（F=16.653,P=0.002＜0.05）。细胞外正常Ca2+溶度时,ET-1作用前加入电压依赖型钙通道阻滞剂Nifedipine(10-6mol/L)或非特异性离子通道拮抗剂SKF96365(10-7mol/L)后,ET-1促[Ca2+]i升高作用都明显减弱,有显著性差异（P=0.001＜0.05）。SKF96365与Nifedipine减弱ET-1促[Ca2+]i升高作用的影响无显著差别（P=0.720＞0.05）。3、Ryanodine受体激动剂Ryanodine(50×10-6mol/L)后,ET-1促[Ca2+]i的作用减弱（t=11.353,P=0.004＜0.05）。加入磷脂酶C（PLC）抑制剂U73122(10-5mol/L)后,ET-1促[Ca2+]i的作用减弱（P=0.015＜0.05）,而U73122无活性类似物U73433(10-5mol/L)不影响ET-1促[Ca2+]i的作用（P=0.921＞0.05）。蛋白激酶C（PKC）抑制剂Staurosporine(2×10-9mol/L)对ET-1促[Ca2+]i的作用无显著变化（t=0.712,P=0.486＞0.05）。第三部分细胞内钙在内皮素-1促肺腺癌细胞SPC-A1生长中的作用本实验部分在上述一、二的基础上采用MTT法测细胞生长,当细胞外无Ca2+时及使用特异性L-型Ca2+通道阻滞剂及PLC特异性拮抗剂等,观察ET-1促肺腺癌细胞生长的作用是否受影响,探讨细胞内钙在ET-1促肺腺癌细胞生长中的作用。实验结果以均数±标准差（（?）±s）表示,相关数据采用SPSS11.5软件进行分析,两组之间比较采用t检验;多组之间比较采用one-way ANOVA方差分析,而后不同组间比较采用LSD检验,实验组与对照组比较用Dunnett’s检验。P＜0.05判定为差异有统计学意义。结果显示:1、细胞外无Ca2+并用EGTA进一步清除细胞外二价离子形成细胞外无Ca2+溶液,ET-1促SPC-A1细胞生长的作用显著受抑制（P=0.001＜0.05）。L-型Ca2+通道阻滞剂Nifedipine(10-6mol/L)能够阻断ET-1促SPC-A1细胞生长作用（P=0.001＜0.05）。2、磷脂酶C特异性（PLC）拮抗剂U73122也能够部分抑制ET-1促SPC-A1细胞生长的作用（P=0.001＜0.05）;U73122类似物U73433对ET-1的上述作用无影响（P=0.986＞0.05）。结论:在体外,ET-1通过激活人肺腺癌SPC-A1细胞ETAR受体促进细胞生长及[Ca2+]i升高,作用均呈浓度依赖性。细胞内Ca2+升高是ET-1促SPC-A1增殖的主要细胞学机制。L-型电压依赖型Ca2+通道开放致Ca2+内流、PLC/IP3途径钙释放途径均参与上述过程。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 内皮素-1及其受体对肺腺癌细胞SPC-A1生长的影响
• 1.1 材料和方法
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• 1.4 小结
• 1.5 参考文献
• 第二章 内皮素-1及其受体对肺腺癌SPC-A1细胞内钙离子浓度的影响及信号转导通路
• 1.1 材料和方法
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• 1.4 小结
• 1.5 参考文献
• 第三章 细胞内钙在内皮素-1促肺腺癌细胞SPC-A1生长中的作用
• 1.1 材料和方法
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• 1.4 小结
• 1.5 参考文献
• 结论
• 创新与意义
• 在学期间发表相关的学术文
• 致谢
• 统计学证明