论文摘要
根据植物青枯菌（Ralstonia solanacearum）群体猝灭基因aac序列,设计合成一对特异性引物P1/P2,以实验室保存的质粒pET-aac为模板,PCR扩增获得大小为2388 bp的aac基因片段,连接aac片段到pGEM-T easy载体。采用内切酶EcoRⅠ和HindⅢ同时处理pGΩ4A质粒,回收Ω4A片段,与经相同双内切酶处理的pUC19载体连接,对其重组质粒进行酶切及测序鉴定。pUC19-Ω4A与pGEM-aac质粒分别进行XhoⅠ内切酶处理,将获得的aac片段连接到pUC19-Ω4A质粒。EcoRⅠ/HindⅢ双酶切质粒pUC19-Ω4A-aac和植物表达载体pBI121,将Ω4A-aac片段导入pBI121,获得aac基因高效植物表达质粒pBI121-Ω4A-aac。采用电击法将pBI121-Ω4A-aac导入根癌农杆菌LBA4404感受态细胞中,叶盘法分别转化烟草感病品种NC89及番茄品种中蔬5号。经过愈伤诱导及卡那霉素（Kan）筛选,分别获得转aac基因烟草57株和转aac基因番茄24株。经过PCR、RT-PCR、Southern、ELISA等分子检测,表明aac基因已经成功整合到转基因植株的基因组中,并进行正确地转录和表达。对获得的转aac基因烟草及番茄进行温室抗青枯病鉴定。青枯菌接种实验结果表明,转aac基因烟草植株的抗病性较非转基因植株明显增强,提高2-2.9个抗性级别,评价为中等抗病水平,表现为发病或者萎焉症状的时间延迟,病情指数的降低。证明将青枯菌群体猝灭基因导入植物,是提高植物对青枯病抗性的有效策略。
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