金铁锁毛状根的诱导和液体培养技术

论文摘要

金铁锁（Psammosilene tunicoides）是中国西南地区特有的珍稀濒危药用植物，具有镇痛、抗炎、止血、免疫调节等功效，有极高的药用价值。通过发根农杆菌诱导药用植物外植体产生毛状根，然后进行液体培养，无论在生物量的增加、药用有效成分的积累还是生产稳定性方面，都显示了独特的优越性。因此，利用毛状根培养的方式获得天然活性成分，己经成为药用植物细胞工程领域的研究热点。本研究利用发根农杆菌ACCC10060侵染金铁锁幼叶及茎段，通过对外植体的选择、菌液浓度、侵染时间、预（共）培养时间、除菌条件的优化，建立金铁锁毛状根的培养体系，然后将转化的毛状根在不含激素的培养基上快速培养，并进行参数测定和形态观察分析。主要结果如下：1、根据毛状根诱导率对外植体（叶片、茎段）进行筛选，发现经过48小时预培养后，幼嫩叶片比茎段的诱导率高；转化的毛状根具有激素自养和抗卡那霉素的特性，并且组织中含有冠瘿碱，表明诱导的毛状根属于发根农杆菌侵染外植体后产生的转化根。2、在共培养基中加入乙酰丁香酮（AS）可明显提高金铁锁毛状根诱导率，AS浓度为20mg·L-1时，其诱导率最高为69%。3、在共培养后外植体的除菌过程中，在B5培养基中添加500mg·L-1头孢噻肟钠抑菌效果最佳，除菌率达83%。4、诱导的毛状根在B5无激素固体培养基中生长到2-3cm时，转入无激素的1/2MS液体培养基中培养，35d后金铁锁毛状根生物量增加了14.11倍（鲜重）和8.39倍（干重）；其总皂苷含量为0.857%（干重），愈伤组织和原植物中分别为0.388%，0.217%。5.制备的金铁锁毛状根表现出激素自主、生长速度快、多分支等特点，适合后续毛状根规模化培养。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 第一章 绪论
• 1.1 药用植物金铁锁研究概述
• 1.1.1 金铁锁的生物学特性
• 1.1.2 金铁锁的分布及资源现状
• 1.1.3 金铁锁的化学成份及药理作用
• 1.1.4 金铁锁的应用前景
• 1.2 发根农杆菌和 Ri 质粒研究
• 1.2.1 发根农杆菌及其生物学特性
• 1.2.2 Ri 质粒的基因结构与功能
• 1.2.3 Ri 质粒的致病机理
• 1.3 毛状根的遗传转化及应用
• 1.3.1 毛状根的形成
• 1.3.2 毛状根的转化方法
• 1.3.3 毛状根的除菌培养
• 1.3.4 毛状根分化成再生植株
• 1.3.5 毛状根的特性
• 1.3.6 毛状根的研究进展
• 1.3.7 毛状根遗传转化的应用
• 1.4 影响毛状根转化的因素
• 1.4.1 植物种类和外植体的取材部位
• 1.4.2 菌液浓度
• 1.4.3 外植体预（共）培养时间
• 1.4.4 添加乙酰丁香酮
• 1.4.5 添加除菌抗生素
• 1.5 实验的特点及研究意义
• 1.6 研究内容及技术路线
• 1.6.1 研究的主要内容
• 1.6.2 研究的技术路线
• 第二章 金铁锁毛状根体系的建立
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 细菌菌株
• 2.2 实验试剂
• 2.3 主要仪器及设备
• 2.4 实验方法
• 2.4.1 菌种的保存与活化方法
• 2.4.2 培养基和试剂配制的方法
• 2.4.3 金铁锁毛状根诱导培养的方法
• 2.4.3.1 金铁锁无菌苗的获得
• 2.4.3.2 毛状根的诱导
• 2.4.3.3 诱导毛状根的单因素实验设计
• 2.4.4 金铁锁毛状根的鉴别
• 2.4.4.1 根据毛状根的形态鉴别
• 2.4.4.2 根据抗卡那霉素特性进行鉴别
• 2.4.4.3 通过层析法鉴定冠瘿碱
• 2.4.5 液体培养及生长曲线的测定
• 2.4.6 金铁锁皂苷含量的测定
• 第三章 结果与分析
• 3.1 外植体选择对金铁锁毛状根诱导率的影响
• 3.2 预培养时间对金铁锁毛状根诱导率的影响
• 3.3 菌液浓度对金铁锁毛状根诱导率的影响
• 3.4 侵染时间对毛状根诱导率的影响
• 3.5 共培养时间对毛状根诱导率的影响
• 3.6 AS 对毛状根诱导率的影响
• 3.7 抗生素头孢噻肟钠对除菌率的影响
• 3.8 毛状根的抗卡那霉素筛选培养
• 3.9 毛状根冠瘿碱检测
• 3.10 金铁锁毛状根的液体培养
• 3.11 金铁锁毛状根总皂苷含量
• 第四章 讨论
• 4.1 关于外植体
• 4.2 关于预培养时间
• 4.3 关于菌液侵染浓度
• 4.4 关于侵染时间
• 4.5 关于共培养时间
• 4.6 关于 AS 的添加
• 4.7 关于除菌培养
• 4.8 关于毛状根的鉴定
• 4.9 关于毛状根的液体培养
• 4.10 结论
• 参考文献
• 硕士期间参与的科研项目及成果
• 致谢