论文摘要
SAMP8 （senescence accelerated mouse prone/8）是一种快速老化模型小鼠,以中枢学习记忆功能呈增龄性加速衰退为主要特征,是研究衰老及衰老相关学习记忆障碍发生机制的良好动物模型。本研究以SAMP8小鼠和对照SAMR1小鼠为研究对象,选择与学习记忆密切相关的2个脑区——海马和皮层,运用差异蛋白质组学方法,比较了5、10、15月龄SAMP8小鼠与同龄SAMR1小鼠蛋白表达的差异；同时还分别比较了2种小鼠在增龄过程中的蛋白表达变化,以期发现脑衰老相关的新蛋白。此外,我们在快速老化SAMP8小鼠和自然衰老Wistar大鼠中检测了SAMP8中的主要蛋白差异点——泛素C末端水解酶（ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase, UCH）的表达水平和酶活性。并在原代培养的皮层神经元中进一步探讨了UCH对衰老及阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）中的重要病理特征——过度磷酸化tau蛋白聚积的影响及可能机制。具体结果如下：第一部分快速老化模型小鼠增龄过程中相关脑区的差异蛋白质组学研究1.SAM小鼠海马和皮层组织二维电泳方法的建立采用双向电泳技术,分别对5、10、15月龄SAMP8及SAMR1小鼠的海马和皮层总蛋白进行分离,制备蛋白表达谱,每个样品均可分离出约1,700个蛋白点。2. SAMP8与SAMR1小鼠相比的蛋白差异点将5、10、15月龄SAMP8小鼠的海马和皮层蛋白与同龄SAMR1小鼠进行差异蛋白质组学比较,共发现13个差异点。其中12个差异点在3个月龄SAMP8小鼠海马和皮层中的变化趋势一致：点1481在SAMP8小鼠中的表达水平显著增加,点173a和293在SAMP8小鼠中消失,点173b、173c、1144a和1404在SAMP8小鼠中的表达水平显著降低,点173d、316、915、1144b和1475仅表达于SAMP8小鼠中；另外,有1个差异点（点2379）仅在15月龄SAMP8小鼠海马中显著降低。3.SAM小鼠增龄过程中的蛋白差异点在SAMP8小鼠海马组织的增龄过程中,发现4个差异点：其中点1333和2440随增龄显著增加,点2379和2524随增龄显著降低。SAMP8小鼠皮层组织的增龄过程中,除与海马组织相同的3个点外（点1333、2440和2524）,新出现4个差异点：其中点2309随增龄显著增加,点1427、1507和1862随增龄显著降低。在SAMR1小鼠海马组织的增龄过程中,发现3个差异点：其中点1333和2440随增龄显著增加,点2524随增龄显著降低。SAMR1小鼠皮层组织的增龄过程中,除与海马组织相同的3个点外,新出现4个差异点：其中点2309随增龄显著增加；点1427、1507和1862随增龄明显降低。4.差异点的质谱分析及鉴定目前,在SAMP8与SAMR1小鼠相比的蛋白差异点中,已有9个被成功鉴定：点173a-d均为mitofilin,点1144a为an unnamed protein product （gi|12847201）的全长形式,点1144b为该蛋白的N端缺失形式,点1404为ubiquitin carboxyl-terminal esteraseL3（UCH-L3）,点1481为adenylate kinase 4 （AK4）,点2379为heme binding protein 10除mitofilin和UCH-L3外,其他差异点与衰老的关系此前均未见报道。在SAM小鼠衰老过程中的蛋白差异点中,有7个被成功鉴定：点1333为N-myc downstream regulated gene 2 （NDRG2）,点1427为an unnamed protein product （gi|74214304）,点1507为enolase 2 （gamma neuroal）,点1862为an unnamed protein product （gi|74178239）,点2309为myosin,点2379为heme binding protein 1,点2524为Cu/Zn superoxide dismutase （Cu/Zn SOD）。除Cu/Zn SOD外,其他差异点与衰老的关系此前均未见报道。第二部分差异点———泛素C末端水解酶的表达及功能研究第一节泛素C末端水解酶在快速老化模型小鼠和自然衰老大鼠中的表达及功能研究为验证蛋白质组学结果,我们进一步检测了UCH-L3及其重要同工酶UCH-L1在5、15月龄SAMP8和SAMR1小鼠中的表达水平和酶活性,以及UCH的下游产物单体泛素（mono-Ub）、磷酸化tau蛋白的水平。此外,还比较了UCH-L1、UCH-L3在自然衰老Wistar大鼠（26月龄）和青年Wistar大鼠（3月龄）中的变化。1. UCH-L1表达及功能改变15月龄SAMP8小鼠皮层中UCH-L1的mRNA水平与同龄SAMR1小鼠相比无显著性差异。其蛋白水平和酶活性仅在15月龄SAMP8小鼠皮层中降低；而在5月龄海马和皮层,以及15月龄海马中UCH-L1的蛋白水平和酶活性在SAMP8和：SAMR1小鼠间无统计学差异。老年大鼠海马和皮层中UCH-L1的蛋白水平与青年大鼠相比没有差异,但酶活性明显降低。2. UCH-L3表达及功能改变15月龄SAMP8小鼠皮层中UCH-L3的1nRNA水平与同龄SAMR1小鼠相比无显著性差异。5、15月龄SAMP8小鼠海马和皮层中UCH-L3的蛋白水平和酶活性与同龄SAMR1小鼠相比均明显降低。老年大鼠皮层中UCH-L3的蛋白水平和酶活性均显著降低；老年大鼠海马中UCH-L3的蛋白水平虽然没有降低,但是酶活性与青年大鼠相比明显降低。3.SAM小鼠海马和皮层中mono-Ub及磷酸化tau蛋白检测与同龄SAMR1小鼠相比,15月龄SAMP8小鼠皮层中mono-Ub的表达水平明显降低；而5月龄海马和皮层,以及15月龄海马中mono-Ub水平在SAMP8与SAMR1小鼠间无统计学差异。此外,在增龄过程中,两种小鼠海马和皮层中mono-Ub水平均显著降低。与同龄SAMR1小鼠相比,5、15月龄SAMP8小鼠海马和皮层中tau蛋白Ser199/202位点和Ser396位点磷酸化水平均显著升高。第二节泛素C末端水解酶活性对磷酸化tau蛋白的影响及机制研究1. UCH-L1抑制剂（LDN-57444）对皮层神经元中UCH-L1抑制的量效及时效关系2.5μM、5μM、7.5μM和10μMUCH-L1抑制剂能剂量依赖性的抑制原代培养皮层神经元中UCH-L1的酶活性。选择7.5μM剂量,分别处理细胞30 min、1 h、2 h、6 h、12 h、24 h和48 h后,结果显示,在前12 h内,随UCH-L1抑制剂处理时间的延长,UCH-L1活性呈时间依赖性降低；其后无进一步的变化。2. UCH-L3抑制剂（4,5,6,7-Tetrachloroindan-1,3-dione）对皮层神经元中UCH-L3抑制的量效及时效关系2.5μM、5μM、10μM和20μMUCH-L3抑制剂能剂量依赖性的抑制原代培养皮层神经元中UCH-L3的酶活性。选择10μM剂量,分别处理细胞30 min、1 h、2 h、6 h、12 h、24 h和48 h后,结果显示,在前12 h内,随UCH-L3抑制剂处理时间的延长,UCH-L3活性呈时间依赖性降低；其后无进一步的变化。两种酶抑制剂的量效关系结果显示,7.5μMUCH-L1抑带剂和10μMUCH-L3抑制剂可使各自的酶活性降低相同的程度,约60%。3. UCH-L1抑制剂、UCH-L3抑制剂分别及同时使用,对正常神经元中磷酸化tau蛋白的影响本实验使用7.5μMUCH-L1抑制剂、10μMUCH-L3抑制剂,将它们分别或同时作用于原代培养皮层神经元2h、6h、12h、24h和48h后,检测pSer199202 tau蛋白和pSer396 tau蛋白的表达水平,结果发现：与control组相比,UCH-L1抑制剂单独使用、UCH-L3抑制剂单独使用及二者合用处理2h均可使神经元中pSer199/202tau蛋白和pSer396 tau蛋白显著增加达最高水平,在6h和12h时降低至与control组无明显差异,而在24h和48h时又明显增加,但仍低于2h的水平。而且,在这2种酶活性的抑制程度相同的条件下,UCH-L3抑制所致的磷酸化tau蛋白聚积作用明显强于UCH-L1抑制作用。4.GSK-3β和PP2A在UCH-L1抑制剂/UCH-L3抑制剂诱导的磷酸化tau蛋白聚积中的作用Tau蛋白的磷酸化水平受到蛋白激酶的磷酸化和磷酸酶的去磷酸化的双重调节,因此我们检测了UCH抑制剂对原代培养皮层神经元中pY216/279 GSK-3β（GSK-3β的活性形式）、总GSK-3β和PP2A催化亚基蛋白水平的影响。pY216/279 GSK-3β的检测结果显示：在2h时间点,UCH-L1抑制剂单独使用、UCH-L3抑制剂单独使用及二者合用均可使神经元中pY216/279 GSK-3β表达水平显著升高；而在其他时间点,3组对pY216/279 GSK-3β的表达水平均无影响。总GSK-3β检测结果显示：3组处理2h、6h、12h对总GSK-3β的表达水平均无明显影响；而在24h和48h时,总GSK-3β的表达水平明显降低。PP2A催化亚基检测结果显示：3组处理2h、6h、12h、24h和48h,均可使PP2A催化亚基的表达水平显著降低,且没有表现出时间依赖性影响,即各时间点的相对降低程度无差异。提示,GSK-3β的激活和PP2A的抑制可能参与了UCH-L1抑制剂UCH-L3抑制剂诱导的正常神经元中过度磷酸化tau蛋白的聚积。5.高磷酸化tau蛋白状态下,UCH抑制对神经元中磷酸化tau蛋白聚积的影响及可能机制5.1冈田酸（okadaic acid, OA）对tau蛋白磷酸化水平的影响量效关系结果显示,OA可以以剂量依赖性的方式诱导神经元中AD样的多个位点的tau蛋白过度磷酸化。时效关系结果显示,与control组相比,25 nM OA处理3h可使神经元中多个位点的磷酸化tau蛋白水平显著增加,处理6h继续增加达最高水平,而后逐渐降低,但在12h和24h时其表达水平仍明显高于control组,48h时降低至与control组无明显差异。提示,在UCH未受抑制的正常神经元中,OA引起的过度磷酸化tau蛋白聚积在48h内即能被清除,使细胞恢复正常状态。5.2 UCH-L1抑制剂/UCH-L3抑制剂对OA诱导的过度磷酸化tau蛋白的影响选择24h和48h时间点,在加入OA的同时加入UCH抑制剂,检测pSer199/202 tau蛋白和pSer396 tau蛋白的表达水平。pSer199/202 tau蛋白的检测结果显示：UCH-L3抑制剂与OA共同作用24h时pSer199/202 tau蛋白水平比OA单独处理组明显增高,而UCH-L1抑制剂和OA共同处理24h与OA单独处理组相比无显著性差异；在48h时间点,合并使用UCH-L3抑制剂组和合并使用UCH-L1抑制剂组的pSer199／202 tau蛋白水平均显著高于OA单独处理组。pSer396 tau蛋白的检测结果显示：与OA单独处理24h相比,合并使用UCH-L3抑制剂组的pSer396 tau水平明显升高,而合并使用UCH-L1抑制剂与OA单独处理组相比无显著性差异；在48h时间点,合并使用UCH-L3抑制剂和合并使用UCH-L1抑制剂均比OA单独处理组有一定程度升高,但无显著性差异。提示,当UCH被同时抑制时,OA诱导的过度磷酸化tau蛋白不能被及时清除。而且,UCH-L1抑制剂的这种作用比较微弱,而UCH-L3抑制剂的作用要明显强于UCH-L1抑制剂的作用。5.3 GSK-3β在UCH-L1抑制剂/UCH-L3抑制剂与OA相关的磷酸化tau蛋白聚积中的作用25 nM OA单独处理3h使神经元中pY216/279 GSK-3p表达水平显著增加,处理6h继续增加达最高水平,而后逐渐降低,但在12h时其表达水平仍高于control组,继续处理至24h和48h时,降低至与control组无明显差异。而总GSK-3β的表达水平在OA单独处理的整个过程中无变化。此外,与OA单独处理24h相比,合并使用UCH-L3抑制剂和合并使用UCH-L1抑制剂对神经元中pY216/279 GSK-3β和总GSK-3β的表达水平均无显著性影响；与OA单独处理48h相比,合并使用UCH-L3抑制剂能显著增加pY216／279GSK-3β水平及显著降低总GSK-3β水平,而合并使用UCH-L1抑制剂对pY216／279GSK-3β表达无影响,但能显著降低总GSK-3β水平。提示,GSK-3β可能在UCH-L1抑制剂,UCH-L3抑制剂稳定OA诱导的磷酸化tau蛋白聚积中发挥作用。5.4 PP2A在UCH-L1抑制剂/UCH-L3抑制剂与OA相关的磷酸化tau蛋白聚积中的作用PP2A催化亚基的表达水平在OA单独处理的整个过程中无变化。UCH-L3抑制剂与OA共同作用24h和48h后,PP2A催化亚基表达水平与OA单独处理组相比均无显著性差异；而UCH-L1抑制剂与OA共同处理24h和48h后,PP2A催化亚基表达水平与OA单独处理组相比均明显降低。提示,PP2A可能在UCH-L1抑制剂稳定OA诱导的磷酸化tau蛋白聚积中起作用,而UCH-L3抑制剂稳定OA诱导的磷酸化tau蛋白聚积可能不是通过影响PP2A催化亚基的表达水平来发挥作用的。
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