人类重组蛋白PLA2G12A的制备

论文摘要

目前,抗癌及抗炎药物在临床上应用的一个主要缺陷,在于其对于肿瘤治疗及炎症治疗的特异性和对正常细胞所产生的负作用。人类PLA2G12A基因广泛的存在于人的各类组织中,其催化作用依赖于钙离子水平及组氨酸的活性部位。PLA2G12A的酶活性相对较低,能够参与脂类代谢过程,对炎症与肿瘤的发生发展具有一定的影响。本研究利用了分子生物学的相关技术制备了人类重组蛋白PLA2G12A,为进一步研究PLA2G12A的生物学功能及其应用奠定了一定的基础。首先,根据GeneBank中登记的序列号,通过设计特异性引物,利用PCR技术扩增得到了全长为570bp的PLA2G12A基因片段,通过酶切,酶连等方法将此片段克隆到大肠杆菌表达载体pET30a中,构建了重组质粒表达载体pET30a-PLA2G12A。经过测序和序列比对,与GeneBank数据库中的序列完全一致,重组质粒表达载体构建成功。将重组质粒表达载体pET30a-PLA2G12A转入大肠杆菌表达菌BL21中进行表达,得到经IPTG诱导表达后的目的蛋白。经SDS-PAGE电泳检测可知,目的蛋白主要以包涵体的形式进行胞内表达。利用亲和层析的方法,对目的蛋白进行纯化,通过Bradford法分析纯化后的蛋白,所测得的蛋白最终浓度为0.113mg/mLo经Western Blot分析,证实所表达的蛋白即为所需的目的蛋白PLA2G12A。因此,人类重组蛋白PLA2G12A制备成功。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 2超家族的概况'>1.1 磷脂酶A₂超家族的概况
• 2的来源'>1.1.1 磷脂酶A₂的来源
• 2的分类'>1.1.2 磷脂酶A₂的分类
• 2的生物学作用'>1.1.3 磷脂酶A₂的生物学作用
• 2G12A的概况'>1.2 PLA₂G12A的概况
• 2G12A的结构特征'>1.2.1 PLA₂G12A的结构特征
• 2G12A的生物学特性'>1.2.2 PLA₂G12A的生物学特性
• 2G12A的研究现状'>1.2.3 PLA₂G12A的研究现状
• 2、炎症和肿瘤的关系'>1.3 sPLA₂、炎症和肿瘤的关系
• 1.3.1 炎症的概述
• 1.3.2 炎症与肿瘤
• 2与疾病'>1.3.3 sPLA₂与疾病
• 2与制药'>1.4 sPLA₂与制药
• 2与抗炎药物'>1.4.1 磷脂酶A₂与抗炎药物
• 2与抗癌药物'>1.4.2 sPLA₂与抗癌药物
• 1.5 大肠杆菌表达系统
• 1.5.1 外源基因在大肠杆菌中的表达方式
• 1.5.2 表达载体
• 1.5.3 pET表达系统
• 1.6 研究目的与意义
• 第二章 材料与方法
• 2G12A表达载体的构建'>2.1 pET30a-PLA₂G12A表达载体的构建
• 2.1.1 引言
• 2.1.2 实验材料
• 2.1.3 实验方法
• 2G12A基因的表达、纯化与鉴定'>2.2 PLA₂G12A基因的表达、纯化与鉴定
• 2.2.1 引言
• 2.2.2 实验材料
• 2.2.3 实验方法
• 第三章 结果与讨论
• 2G12A表达载体的构建'>3.1 pET30a-PLA₂G12A表达载体的构建
• 2G12A基因的PCR扩增'>3.1.1 PLA₂G12A基因的PCR扩增
• 2G12A的鉴定'>3.1.2 质粒pET30a-PLA₂G12A的鉴定
• 2G12A的序列测定'>3.1.3 表达载体重组质粒pET30a-PLA₂G12A的序列测定
• 2G12A基因的表达、纯化与鉴定'>3.2 PLA₂G12A基因的表达、纯化与鉴定
• 2G12A基因在大肠杆菌中的表达'>3.2.1 PLA₂G12A基因在大肠杆菌中的表达
• 2G12A的纯化'>3.2.2 目的蛋白PLA₂G12A的纯化
• 2G12A的浓度'>3.2.3 Bradford法测定目的蛋白PLA₂G12A的浓度
• 2G12A的鉴定'>3.2.4 目的蛋白PLA₂G12A的鉴定
• 第四章 讨论与展望
• 4.1 讨论
• 4.2 展望
• 参考文献
• 致谢